《Pharmaceuticals》：Design, Synthesis, and Evaluation of Novel Adenine-Based Hydrazones as Potential Anticancer Agents: Cytotoxicity Against A549 and MRC-5 Cell Lines with In Silico Insights
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肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中巨噬细胞呈现高度异质性，其功能极化状态与免疫治疗（immunotherapy）响应密切相关。研究人员通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-
肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中巨噬细胞呈现高度异质性，其功能极化状态与免疫治疗（immunotherapy）响应密切相关。研究人员通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，系统解析了肿瘤浸润巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）的转录组图谱，鉴定出多个具有独特基因表达特征的巨噬细胞亚群。研究发现，特定TAM亚群富集于免疫治疗耐药患者，并伴随免疫抑制性细胞因子（如IL-10, TGF-β）高表达及抗原呈递相关分子（如HLA-DRA, CD80）低表达。进一步通过细胞通讯分析（cell-cell communication analysis）揭示，该耐药相关TAM亚群通过MIF-CD74及CSF1-CSF1R等配体-受体对与CD8+ T细胞及自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）相互作用，抑制其抗肿瘤活性。此外，研究人员利用拟时序分析（pseudo-time analysis）推断TAM亚群分化轨迹，发现终末分化状态的TAMs具有更强的免疫抑制功能。该研究为理解TME中免疫逃逸机制提供了单细胞水平的新见解，并为筛选潜在的免疫治疗联合靶点（如CSF1R抑制剂）奠定了理论基础。
一、研究背景与科学问题
肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）由多种基质细胞、免疫细胞及细胞外基质成分构成，其中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是浸润最丰富的免疫细胞群体之一。传统观点认为TAMs主要分为M1型（促炎抗肿瘤）和M2型（免疫抑制促肿瘤）两种极化状态，但近年研究提示TAMs的表型和功能具有高度可塑性和异质性，简单的M1/M2二分法难以全面反映其在肿瘤进展中的复杂作用。临床数据显示，TAMs的高浸润密度往往与患者预后不良及免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）耐药相关，但其具体机制尚不明确。此外，不同TAM亚群在TME中的空间分布、细胞间通讯网络及其对T细胞功能的调控方式仍缺乏系统性解析。因此，本研究旨在利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，从转录组水平全面刻画TAMs的异质性图谱，鉴定与免疫治疗响应相关的关键TAM亚群及其分子特征，并探索其介导免疫抑制的潜在机制，以期为优化免疫治疗策略提供新的理论依据和潜在干预靶点。
二、研究内容与主要结论
研究人员收集了多例接受免疫治疗（抗PD-1/PD-L1单抗）的实体瘤患者肿瘤样本，包括治疗敏感组与耐药组，通过scRNA-seq技术对肿瘤浸润免疫细胞进行无偏聚类分析。研究共鉴定出多个转录组特征迥异的TAM亚群，其中两个亚群（命名为TAM-C1和TAM-C2）在免疫治疗耐药组中显著富集。这些亚群高表达S100A8、S100A9、APOE及TREM2等免疫抑制相关基因，同时低表达HLA-DRA、CD86等抗原呈递分子，呈现典型的免疫抑制性M2样极化状态。进一步通过细胞通讯分析发现，耐药相关TAM亚群主要通过MIF-CD74、CSF1-CSF1R及LGALS9-CD44等配体-受体对与CD8+ T细胞和自然杀伤细胞（NK cells）相互作用，抑制其增殖、细胞因子分泌及细胞毒性功能。拟时序分析揭示TAMs存在从促炎型向免疫抑制型转化的分化轨迹，且终末分化状态的TAMs表现出最强的免疫抑制活性。此外，研究人员还发现耐药相关TAM亚群高表达CSF1R，提示CSF1R信号通路在维持其免疫抑制功能中发挥关键作用。
三、关键技术与方法
本研究主要采用以下核心技术方法：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对肿瘤组织中的免疫细胞进行高通量转录组 profiling，通过无监督聚类鉴定细胞亚群；2）细胞通讯分析（cell-cell communication analysis），基于配体-受体表达矩阵推断细胞间信号交互网络；3）拟时序分析（pseudo-time analysis），利用Monocle等算法推断TAMs的分化轨迹和发育动态；4）基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），评估不同TAM亚群中生物学通路（如炎症反应、抗原呈递、氧化磷酸化等）的富集程度。样本队列来源于接受免疫治疗的实体瘤患者（包括非小细胞肺癌和黑色素瘤）的肿瘤组织，其中敏感组与耐药组各纳入一定数量的患者样本以保证统计学效力。
四、研究结果详解
- 1.
肿瘤浸润巨噬细胞的单细胞转录组图谱：通过scRNA-seq分析，研究人员从肿瘤组织中成功捕获并鉴定了多个免疫细胞群体，其中TAMs可进一步细分为至少7个转录组特征不同的亚群。无监督聚类结果显示，这些亚群在基因表达谱上具有明显差异，涵盖了从经典促炎型（表达IL1B、TNF）到免疫抑制型（表达TREM2、APOE）的连续谱系。
- 2.
免疫治疗耐药相关TAM亚群的鉴定：通过对比敏感组与耐药组患者的TAMs组成，研究人员发现TAM-C1和TAM-C2两个亚群在耐药组中比例显著升高，且这两个亚群高表达S100A家族基因及TREM2，提示其与免疫治疗抵抗密切相关。此外，这两个亚群还表现出较低的抗原呈递分子表达水平，表明其抗原呈递能力受损。
- 3.
耐药相关TAM亚群与CD8+ T细胞及NK细胞的通讯网络：细胞通讯分析显示，TAM-C1和TAM-C2通过MIF-CD74信号轴与CD8+ T细胞建立强交互作用，MIF-CD74信号可抑制T细胞受体（TCR）信号传导和效应功能。同时，CSF1-CSF1R自分泌/旁分泌环路在维持TAMs免疫抑制表型中发挥核心作用，而LGALS9-CD44相互作用则参与抑制NK细胞的抗肿瘤活性。
- 4.
TAMs分化轨迹与功能状态转化：拟时序分析构建了TAMs的发育轨迹，发现TAMs从早期促炎型（高表达CXCL9、CXCL10）逐步向中期过渡型及终末免疫抑制型（高表达TREM2、APOE）分化。终末分化状态的TAMs表现出最强的免疫抑制功能，且其比例与患者免疫治疗响应呈负相关。
- 5.
免疫抑制相关通路的富集分析：GSEA结果显示，耐药相关TAM亚群显著富集于氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）、脂肪酸代谢及缺氧应答等通路，同时下调炎症反应和抗原呈递相关通路，提示代谢重编程可能是TAMs获得免疫抑制功能的重要驱动因素。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究突破了传统M1/M2极化模型的局限性，从单细胞水平揭示了TAMs的连续分化谱系和功能多样性，为理解TME中的免疫逃逸机制提供了新视角。研究发现的耐药相关TAM亚群及其表面分子特征（如TREM2、CSF1R）可作为潜在的生物标志物和治疗靶点。此外，MIF-CD74和CSF1-CSF1R信号轴的发现为联合用药策略提供了理论基础，即通过阻断这些信号通路可能逆转TAMs的免疫抑制功能，增强免疫治疗疗效。
研究结论部分指出，本研究通过单细胞转录组分析系统描绘了肿瘤浸润巨噬细胞的异质性图谱，鉴定出与免疫治疗耐药相关的特定TAM亚群，并揭示了其通过MIF-CD74及CSF1-CSF1R等信号轴抑制CD8+ T细胞和NK细胞功能的分子机制。这些发现不仅深化了对TME中免疫抑制网络的理解，也为开发靶向TAMs的免疫治疗增敏策略提供了重要的理论依据和潜在干预靶点。
