Werneria glaberrima全提取物及ent-kaurenoic acid对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激的细胞保护与抗氧化活性及植物化学成分研究

《Molecules》：Phytochemical Composition, Cytoprotective and Antioxidant Activity of Werneria glaberrima Against H2O2-Induced Oxidative Stress in Human SH-SY5Y Neuroblastoma Cells

　　

来自极端环境（如阿塔卡马沙漠）的植物是新型生物活性代谢物的未充分开发来源，因为强烈紫外线辐射、热振幅和水资源匮乏迫使当地植物区系依赖特化的生化防御。Werneria glaberrima是一种高安第斯物种，在智利北部被用作传统药用植物，用于子宫疼痛和促进分娩，其化学特征为异戊烯基化苯乙酮、苯并呋喃衍生物和三萜类。尽管分类学相关的高安第斯物种Senecio nutans已显示抗氧化活性，但W. glaberrima的抗氧化和氧化还原调节活性仍未探索。氧化应激是活性氧（ROS）产生与抗氧化能力之间的失衡，参与癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病的病理生理。本研究表征了W. glaberrima总提取物（TE）的植物化学成分，并评估了TE及三个分离代谢物Wg-1（ent-kaurenoic acid）、Wg-2（dihydrobenzofuran 6-hydroxytremetone）和Wg-3（4-hydroxy-3-prenylacetophenone）在人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的生物相容性和细胞保护作用。研究人员还评估了它们减弱过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞内促氧化环境的能力。TE具有生物相容性和细胞保护性，而Wg-2在分离代谢物中显示最宽生物相容性窗口。TE或Wg-1预处理保护SH-SY5Y细胞免受不同H₂O₂浓度诱导的损伤，并在测试浓度下降低H₂O₂诱导的DCF氧化。这些结果为W. glaberrima TE的首次化学表征及该提取物和Wg-1的细胞保护和抗氧化潜力的初步体外证据。

研究背景：高安第斯和极端环境植物因强紫外辐射、热振幅、缺氧和水资源匮乏而形成特殊化学多样性，是新型生物活性代谢物的重要但尚未充分开发生物资源。Werneria glaberrima为智利北部高安第斯传统药用植物，用于子宫疼痛、助产和膀胱相关病症；该属化学研究曾报道异戊烯基化对羟基苯乙酮、苯并呋喃、色烯、香豆酸酯及ent-kaurane和ent-labdane二萜等，部分成分具有抗菌、抗HIV、降压和光保护活性。尽管分类学相关的Senecio nutans已有体外抗氧化和抗菌活性报道，但W. glaberrima的抗氧化和氧化还原调节作用尚未研究；其根和地上部分提取物的植物化学轮廓亦表征不足，且提取物中代谢物能否调节细胞内ROS水平或保护细胞免受氧化损伤尚不清楚。氧化应激与癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病病理生理相关，因此研究人员开展本研究以填补上述知识空白。

研究开展与结论意义：研究人员对W. glaberrima地上部分总提取物（TE）进行植物化学成分表征，采用标准化学法评价其体外抗氧化活性，并在人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中评估TE及三个分离代谢物Wg-1（ent-kaurenoic acid）、Wg-2（dihydrobenzofuran 6-hydroxytremetone）和Wg-3（4-hydroxy-3-prenylacetophenone）的生物相容性、对H₂O₂诱导细胞损伤的细胞保护作用及对H₂O₂诱导细胞内促氧化环境的调节能力。结论显示TE具有生物相容性和细胞保护性，Wg-2在分离代谢物中生物相容性窗口最宽；TE或Wg-1预处理可保护SH-SY5Y细胞抵抗不同浓度H₂O₂诱导的损伤，并在测试浓度下降低H₂O₂诱导的DCF氧化。该研究首次对W. glaberrima TE进行化学表征，并提供该提取物和Wg-1具有细胞保护和抗氧化潜力的初步体外证据，为后续活性成分鉴定及更接近生理和氧化应激相关病理模型中的评价提供基础。

关键技术方法（不超过250字）：地上部分采自智利Antofagasta地区El Tatio附近（22°20′35.4″ S；68°01′25.9″ W；4273 m a.s.l.），凭证标本CONC 185.346，对照No. 007-2022。制备乙醇-水（1:1）TE，经液-液分配、硅胶柱和Sephadex LH-20分离；以超高效液相色谱-电喷雾-四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-ESI-QOrbitrap-MS）注释成分，1D/2D核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认Wg-1至Wg-3；采用总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、铁还原抗氧化能力（FRAP）、金属螯合、DPPH和ABTS^•+法评价体外抗氧化；SH-SY5Y细胞用Alamar Blue测活力、H₂DCF-DA测6 h内DCF荧光，并以单因素/双因素ANOVA分析。

研究结果：
2.1 Phytochemical Study of Werneria glaberrima by UHPLC-ESI-QOrbitrap-MS：通过UHPLC-ESI-QOrbitrap-MS分析TE，共 tentative 注释21个化合物；酚酸类最丰富（7个），其次脂肪酸（4个），黄酮类第三（3个黄酮醇：kaempferol、kaempferol-3-O-rutinoside、combretol），另含二萜、糖/糖苷衍生物、二苯乙烯糖苷rhapontin、环烯醚萜葡萄糖苷asperuloside及萘乙酸衍生物。该研究首次对W. glaberrima TE进行植物化学成分表征。
2.1.1 Phenolic Acids：注释quinic acid、chlorogenic acid、neochlorogenic acid、cynarine、salicortin、3,4-dimethoxycinnamic acid、acetylsalicylsalicylic acid及Kassinol K（原文后文亦作Kazinol K）。
2.1.2 Terpenes：注释asperuloside（在W. glaberrima中首次tentative报道）、ent-kaur-16-en-19-oic acid（分离鉴定）及未知二萜C₂₀H₂₉O₃。
2.1.3 Fatty Acids：注释4,7,10,13-tetraoxahexadecanedioic acid、tetracosanoic acid和arachidic acid。
2.1.4 Sugars：注释foliachinenoside H和atractyloside-A-14-O-β-D-fructofuranoside。
2.1.5 Flavones（原文小标题）：注释kaempferol-3-O-rutinoside、combretol和kaempferol。
2.1.6 Stilbenes：注释rhapontin，为Werneria属首次报道。
2.1.7 Naphthylacetic Acid Derivatives：注释6-methoxy-2-naphthylacetic acid；萘型骨架在植物次生代谢物中不常见，其在植物中的存在尚待确立。随后从W. glaberrima分离Wg-1、Wg-2、Wg-3，结构经1D/2D NMR和FT-IR确认。

2.2 In Vitro Characterization of Antioxidant Activity of Werneria glaberrima：TE总酚含量234.6 ± 11.4 mg没食子酸当量/g干提取物，总黄酮含量115.6 ± 8.76 mg槲皮素当量/g干提取物；FRAP为192.7 ± 15.6 mg Trolox当量/g干提取物；DPPH IC₅₀为284.4 ± 14.5 μg/mL，ABTS^•+ IC₅₀为342.4 ± 12.4 μg/mL，金属螯合IC₅₀为116.7 ± 1.6 μg/mL；均低于Trolox或EDTA标准品。结论为TE具有显著多酚负荷但体外自由基清除和金属螯合能力中等而非突出，且为W. glaberrima该性质的首次表征。

2.3 Biocompatibility of the TE and Selected Metabolites of W. glaberrima in SH-SY5Y Cells：TE在6.25–200 μg/mL未降低细胞活力，400 μg/mL出现显著细胞毒作用；Wg-1生物相容性范围较窄，6.25 μg/mL未见显著降低而12.5 μg/mL出现轻度显著降低；Wg-2在分离代谢物中生物相容性窗口最宽，25 μg/mL及以下未显著降低，50 μg/mL及以上逐渐下降；Wg-3自12.5 μg/mL及以上显著降低细胞活力。

2.4 Cytoprotective Effects of TE and Selected Metabolites Against H₂O₂-Induced Cellular Damage：固定预处理设计下，TE（100 μg/mL）对25、50和100 μM H₂O₂显著保留细胞活力，200 μM时保护下降；Wg-1（10 μg/mL）在25和50 μM H₂O₂下呈现最一致的保护作用，较高H₂O₂浓度未见显著保护；Wg-2（10 μg/mL）和Wg-3（10 μg/mL）在任何测试H₂O₂浓度下均未显著改变细胞活力。

2.5 Effects of TE and Selected Metabolites Against H₂O₂-Induced Intracellular ROS Levels：采用DCFH-DA探针在50 μM H₂O₂下进行6 h动力学监测。TE在25、50和100 μg/mL显著降低DCF信号；100 μg/mL时DCF降低伴随细胞活力保护，较低浓度是否伴随活力保护尚待确定。Wg-1在6.25和12.5 μg/mL降低DCF荧光，25 μg/mL反而增加DCF荧光，呈浓度依赖性非单调效应；12.5 μg/mL时基础活力轻度下降需谨慎解释，25 μg/mL时DCF升高且细胞活力约降低50%。Wg-2和Wg-3在各时间点均未显著改变H₂O₂诱导的DCF荧光；Wg-3 12.5 μg/mL使基础细胞活力降至约60%，解释需谨慎。

2.6 Integrated Perspective and Future Directions：整合生物相容性、细胞保护和DCF数据，Wg-1在分离代谢物中总体特征最有利；TE具有宽生物相容性窗口、对H₂O₂的细胞保护及降低H₂O₂诱导的探针氧化。未来应评估TE在25和50 μg/mL较低浓度下是否仍保留细胞保护；TE效应可能来自一个或多个成分，但未评估加和、协同或拮抗作用。Wg-1活性限于较低浓度，其较窄生物相容性范围和25 μg/mL时DCF无显著效应提示需进一步研究。ent-kaurenoic acid的Nrf2（核因子E2相关因子2）激活既往报道为可能背景，但本研究未评估Nrf2核积累或ARE依赖转录及HO-1（血红素加氧酶1）、NQO1（NAD(P)H醌脱氢酶1）、GCLC（谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基）等下游靶点，需功能缺失实验验证。鉴于SH-SY5Y的神经元来源，神经退行性疾病模型、分化神经元、共培养或动物模型可作为后续背景；TE需生物活性导向分离及计算预测以识别其他贡献成分。

讨论部分总结：TE生物相容性较宽、可对抗H₂O₂诱导的活力丧失并降低DCF氧化；Wg-1在低浓度下显示最清晰细胞保护和DCF降低，但生物相容性窗口较窄且机制未确定；Wg-2和Wg-3在测试条件下既不保护也不加剧H₂O₂损伤，且未改变DCF氧化。结构特征不能单独推断活性，Nrf2等机制未被本研究评估，需后续验证；TE的广泛活性不能仅由三个代谢物解释，需进一步分离和测试其他成分。

研究结论部分翻译：本研究首次对高安第斯药用植物W. glaberrima总提取物（TE）进行详细植物化学表征，并在H₂O₂攻击的SH-SY5Y细胞中提供其细胞保护和潜在抗氧化活性的初步体外证据。TE表现出宽生物相容性范围，保护免受H₂O₂诱导的细胞活力丧失，且预处理减弱H₂O₂暴露后细胞内探针氧化。此外，分离出三个代谢物：Wg-1（ent-kaurenoic acid）、Wg-2（苯并呋喃类，benzofuran）和Wg-3（苯乙酮类，acetophenone）。其中，Wg-1在较低浓度下显示细胞保护并伴随SH-SY5Y细胞中H₂O₂诱导DCF荧光降低。相反，Wg-2和Wg-3在测试浓度下既不保护也不加剧H₂O₂诱导的活力丧失，并且未改变H₂O₂暴露后DCF氧化。总体而言，这些结果初步将W. glaberrima定位为具有细胞保护和抗氧化潜力的生物活性化合物来源，为鉴定额外活性成分以及在更生理和氧化应激相关病理模型中评估TE和Wg-1提供基础。