水溶性前药丙帕他莫（Propacetamol）在难治性肿瘤中的抗肿瘤活性增强及机制研究

《Cancers》：Navigating T-Cell-Directed Therapies in Transformed Follicular Lymphoma

　　

背景/目的：三阴性乳腺癌（TNBC）和胰腺导管腺癌（PDAC）是两种致死率最高的成人癌症。高剂量对乙酰氨基酚（AAP）在与细胞色素P450 2E1（CYP2E1）抑制剂联用以阻断肝毒性时具有抗肿瘤活性。然而，高剂量AAP的给药面临实际挑战，其根源在于水溶性有限，难以在有限体积内配制高浓度治疗溶液。丙帕他莫（PROP）是一种水溶性AAP前药，已在临床上作为静脉注射用AAP制剂用于镇痛。方法：研究人员旨在利用可移植的同基因TNBC和PDAC模型，研究PROP与AAP相比的药代动力学、安全性及抗肿瘤活性。结果：在体内，PROP在给药后数分钟内迅速转化为AAP。在TNBC和PDAC同基因小鼠肿瘤模型中，PROP在抑制肿瘤生长方面表现出较AAP更强的有效性。PROP增强的药效似乎源于其细胞摄取增加，导致给药后5分钟内细胞内AAP浓度比未修饰AAP处理细胞高2.7倍。PROP在使用小鼠和人源化模型时，表现出对细胞内JAK/STAT信号传导（AAP抗肿瘤活性的关键介质）的增强调节作用。PROP对STAT3和STAT6的抑制导致巨噬细胞极化调节，这可能有助于其抗TNBC和抗PDAC活性。尽管肠外给药是PROP在抗肿瘤适应症中的首选给药途径，研究人员也评估了口服PROP与口服AAP相比的安全性和有效性。在BALB/c小鼠模型中，高剂量口服PROP相比AAP表现出改善的安全性，同时在体内保持抗肿瘤活性。结论：PROP作为一种AAP前药，与未修饰的AAP相比，表现出增强的细胞内AAP递送和体内抗肿瘤活性，为在不同适应症中作为抗肿瘤药物进行研究奠定了基础。

一、研究背景与问题

三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性和致死性的乳腺癌亚型，激素阳性乳腺癌已从靶向治疗中获益，而TNBC迄今获益甚微。胰腺导管腺癌（PDAC）的治疗同样面临巨大需求，尽管近期达拉索拉西（daraxonrasib）获FDA批准用于胰腺癌，但转移性PDAC的五年生存率仍低于15%。对乙酰氨基酚（AAP）在联合CYP2E1抑制剂（如甲吡唑）预防肝毒性的条件下，可安全地以高剂量（小鼠中高达650 mg/kg）给药，并在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤模型中展现出显著抗肿瘤活性。然而，高剂量AAP的给药面临药物递送挑战：AAP水溶性有限，难以在有限体积内以浓缩溶液形式通过静脉输注给药，口服给药亦不切实际。现有商用静脉用AAP液体制剂（如Ofirmev）浓度为1 g/100 mL，此前临床试验中高剂量AAP用量可达约40 g，若以液体形式给药需约4 L静脉输注溶液，对人体而言是不安全的体积。因此，开发水溶性AAP前药成为克服这一瓶颈的关键策略。丙帕他莫（PROP）是一种高水溶性酯类前药，在欧洲和亚洲已作为肠外（静脉）AAP制剂上市多年，一项涵盖7200名患者的Cochrane系统评价证实了其临床安全性。本研究旨在评估PROP用于高剂量AAP给药的可行性、药代动力学（PK）特性、安全性及抗肿瘤疗效。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统比较了PROP与AAP在多种同基因小鼠肿瘤模型中的药代动力学、安全性及抗肿瘤活性，并深入探讨了PROP增强抗肿瘤活性的潜在机制。研究结果表明，PROP在体内被迅速转化为AAP，其抗肿瘤活性在TNBC和PDAC模型中均显著优于等摩尔剂量的AAP。PROP增强的药效源于其更高效的细胞内递送，导致细胞内AAP浓度在5分钟内即达到AAP处理组的2.7倍。机制层面，PROP通过增强对JAK/STAT信号通路的调节，抑制STAT3和STAT6磷酸化，从而调节巨噬细胞极化，促进“M1”型活化并抑制“M2”型极化，这可能是其抗肿瘤活性的重要基础。此外，口服PROP在BALB/c小鼠中表现出优于口服AAP的安全性，同时保留抗肿瘤疗效。该研究为PROP联合甲吡唑救援方案进入临床评估提供了强有力的临床前依据。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用可移植同基因小鼠肿瘤模型（包括4T1和AT-3三阴性乳腺癌模型，以及PAN02、CKP和KPC胰腺癌模型）进行体内药效评价；通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术测定血清及细胞内AAP浓度以进行药代动力学分析；采用蛋白质印迹（Western blot）和定量PCR（qPCR）检测JAK/STAT信号通路相关蛋白磷酸化水平及基因表达；使用ImageStream成像流式细胞术和常规流式细胞术分析人源化小鼠外周血单个核细胞中pSTAT3阳性CD11b⁺细胞比例；通过骨髓来源巨噬细胞（BMDM）分化模型评估药物对巨噬细胞极化的影响。人源化小鼠通过将人脐血来源的纯化CD34⁺造血干细胞移植入免疫缺陷FLT3 NSG小鼠构建。

四、研究结果

4.1 丙帕他莫在体内较对乙酰氨基酚具有更强的抗肿瘤活性

在4T1三阴性乳腺癌原位模型中，等摩尔剂量给药时，PROP组肿瘤体积（362 ± 76 mm³）显著小于AAP组（471 ± 36 mm³）和对照组（671 ± 32 mm³），且均未引起肝毒性。在PAN02胰腺癌模型中，PROP显著抑制肿瘤生长，而等摩尔AAP仅呈现非显著抑制趋势。在AT-3模型中，PROP单药使肿瘤体积较对照组减少约50%，且PROP联合吉西他滨（gemcitabine）较吉西他滨单药进一步缩小肿瘤（17 ± 1 mm³ vs. 36 ± 15 mm³）。在CKP模型中，PROP治疗15天使肿瘤体积较对照组减少90%；在KPC模型中，PROP活性与吉西他滨相当。此外，另一种水溶性磷酸酯类AAP前药在4T1模型中抗肿瘤效果劣于AAP，因此PROP被选为后续研究的先导化合物。

4.2 丙帕他莫较对乙酰氨基酚具有增强的活性药物细胞内递送

药代动力学分析显示，PROP给药后血清中AAP水平略低于等摩尔AAP给药组，且PROP在所有时间点均低于检测限（10 ng/mL），表明其在体内被酯酶迅速裂解并转化为AAP。肿瘤组织内AAP浓度在两组间相当。体外实验中，PROP处理5分钟即导致细胞内AAP浓度较AAP组高2.7倍，而磷酸酯前药处理的细胞内AAP水平较AAP低83%。在仅30分钟预孵育的条件下，PROP而非AAP能显著抑制STAT6磷酸化，这一结果在C57bl/6小鼠及人源化小鼠来源的BMDM中均得到验证。

4.3 丙帕他莫诱导骨髓来源巨噬细胞“M1”型活化

PROP显著上调“M1”型巨噬细胞关键细胞因子TNF-α和IL-12的表达，同时深度抑制“M2”型基因（IRF4、ARG1、CD206）的表达。蛋白水平上，PROP增加BMDM的TNF-α产生，而AAP未能达到此效果；PROP和AAP均能阻断精氨酸酶（arginase，一种“M2”巨噬细胞免疫抑制标志物）的表达。

4.4 丙帕他莫是STAT3抑制剂

在4T1肿瘤细胞中，30分钟预孵育条件下PROP而非AAP抑制STAT3磷酸化。PROP在人源化小鼠来源的BMDM中同样抑制STAT3磷酸化，且该抑制作用不受救援剂NAC和甲吡唑影响。在人乳腺癌细胞系MDA-MB-436中，PROP处理4小时抑制多个STAT3调控基因的表达。在人源化小鼠体内实验中，PROP处理组外周血中pSTAT3阳性CD11b⁺细胞比例低于仅接受救援剂处理的对照组，提示STAT3磷酸化可能作为PROP临床试验中的药效动力学生物标志物。

4.5 口服丙帕他莫在对乙酰氨基酚相比具有模型依赖性的安全性优势

在BALB/c小鼠中，口服AAP（250 mg/kg）较静脉给药表现出更显著的体重下降和ALT升高，而该现象在C57bl/6小鼠中未观察到。代谢物分析显示，静脉与口服AAP的主要代谢物（AAP-葡萄糖醛酸结合物、AAP-NAC结合物、AAP-硫酸结合物）水平相似，提示代谢差异不能解释不同给药途径的毒性差异。即使在联合甲吡唑的情况下，口服AAP在BALB/c小鼠中仍引起肝毒性（ALT 470 ± 370 U/L），而口服PROP联合甲吡唑则耐受良好且无肝毒性（ALT 41 ± 8 U/L）。口服PROP在4T1模型中表现出与腹腔注射相当的抗肿瘤疗效，其口服药代动力学参数为C_max 332.8 μg/mL，T_max 0.25 h，AUC_0–2h 351.4 μg·h/mL。

五、讨论与结论

讨论部分指出，PROP联合甲吡唑救援方案可能也是一种可行的阿片节省型镇痛药物组合，因为与AAP毒性相关的CYP2E1代谢通路与镇痛作用无关。口服高剂量AAP在BALB/c与C57bl/6小鼠中的差异毒性可能源于两种品系不同的免疫系统特征（BALB/c以Th2型免疫应答为主，C57bl/6以Th1型为主），推测不同的免疫代谢反应可解释该差异。PROP已知的输注相关疼痛可能与其制剂低pH（约3.5）有关，可通过制剂优化或中心静脉给药缓解。PROP增强的抗肿瘤活性可能源于其增强的细胞内AAP递送及随之而来的更有效的JAK/STAT信号调节，STAT3和STAT6在PDAC和TNBC中促进肿瘤生长，是有吸引力的治疗靶点。研究结论为：研究结果提供了强有力的临床前依据，支持将PROP联合甲吡唑救援方案推进至临床评估，用于晚期恶性肿瘤患者的治疗。