可降解CeO2/PLGA纳米纤维敷料的制备及其促进烧伤创面愈合的初步体内评价

《International Journal of Nanomedicine》：Fabrication and Preliminary in vivo Evaluation of a Cerium Dioxide Nanoparticle-Loaded Degradable PLGA Nanofiber Dressing for Burn Wound Healing

　　

背景：传统烧伤敷料可维持湿润创面环境并减少感染，但不能直接对抗烧伤创面床持续存在的氧化应激（oxidative stress）和炎症。二氧化铈（CeO₂）纳米颗粒具有基于氧化还原（redox）的抗氧化活性，促使研究人员将其纳入可吸收敷料。本研究旨在制备并初步评价负载CeO₂的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）纳米纤维敷料用于烧伤创面愈合。方法：研究人员通过静电纺丝（electrospinning）制备负载CeO₂的PLGA纳米纤维和未负载的PLGA纳米纤维，并表征纤维形态、元素组成、拉伸性能、润湿性、吸水率和体外细胞相容性（cytocompatibility）。采用全层大鼠烧伤模型评估28天内的创面愈合，并于第7天和第28天进行组织学分析（histological analysis）。结果：掺入CeO₂的纳米纤维平均纤维直径（159.8 ± 97.6 nm）小于未负载PLGA纳米纤维（267.9 ± 146.3 nm）。CeO₂掺入降低了拉伸强度，但所有纤维在断裂前均保持良好伸长率（> 50%）。在体内，负载CeO₂的纳米纤维在第14天和第21天产生显著大于对照组的暂时性创面面积缩小，并在第14天大于未负载PLGA组（p < 0.05）；到第28天，创面面积趋同，组间差异不再具有统计学意义。组织学分析显示更早的胶原沉积且无不良组织反应。结论：负载CeO₂的PLGA纳米纤维敷料具有生物相容性（biocompatibility），并可在大鼠模型中加速烧伤创面闭合的中间阶段。由于未直接测量CeO₂氧化还原状态、CeO₂释放及体内抗氧化机制，尚不能将改善因果归因于CeO₂，仍需进一步机制研究。

研究背景与问题：烧伤是全球致病和致死的重要原因，造成显著临床与经济负担。热损伤破坏皮肤结构和免疫屏障，引起炎症细胞浸润及创面部位活性氧（reactive oxygen species, ROS）快速积累；生理水平ROS参与抗菌防御和细胞间信号，但过度积累导致脂质过氧化、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）损伤和蛋白氧化，加重细胞死亡与组织损伤并延迟创面闭合。“淤滞带”局部缺血可使最初可存活组织转为不可逆坏死，扩大创面并增加修复难度；热损伤还引起免疫失调，焦痂无血管且富含蛋白，利于细菌定植和增殖，感染是烧伤重要并发症及脓毒症和死亡的主要贡献因素。除液体复苏和手术清创外，局部创面护理依赖局部抗菌药和敷料，如磺胺嘧啶银、离子银敷料、泡沫、水胶体、藻酸盐和生物敷料，以维持湿润环境、降低感染风险和支持愈合；但磺胺嘧啶银需频繁换药、应用疼痛，并对角质形成细胞和成纤维细胞有细胞毒性，且这些传统敷料均未直接针对烧伤创面床持续存在的氧化应激和慢性低度炎症。CeO₂纳米颗粒可增强创面闭合、减少瘢痕、减轻炎症并具有抗菌作用，其多功能性源于Ce³⁺和Ce⁴⁺氧化态可逆循环，从而以催化、自再生方式反复中和自由基；其还可通过缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α）–Ref-1/APE1信号轴支持血管生成。然而，CeO₂疗效高度依赖合成方法和载体配方，现有体内证据在不同平台间异质；将CeO₂掺入可吸收电纺PLGA纳米纤维载体后对纤维形态、力学完整性、润湿性和体内烧伤愈合的具体影响尚未系统建立，且多数CeO₂敷料缺少原位氧化还原活性和释放动力学的直接证据，机制与愈合结果之间仍为推断。为此，研究人员制备可吸收CeO₂/PLGA电纺纳米纤维敷料，评估力学性能，以扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）表征形态，以能谱仪（energy dispersive spectroscopy, EDS）确认CeO₂掺入，并用大鼠烧伤模型和组织学分析评价促修复效果；该研究定位为制备和初步体内评价，CeO₂氧化还原状态、释放动力学和体内抗氧化活性的直接表征不在范围内。研究结论为：该敷料具有生物相容性，可加速大鼠烧伤创面闭合的中间阶段，但因未直接测量CeO₂氧化还原状态、释放和体内抗氧化机制，尚不能因果归因于CeO₂；其意义在于支持可吸收CeO₂/PLGA纳米纤维敷料的可行性，并为后续机制和剂量优化研究提供基础。

关键技术方法：采用静电纺丝制备未负载PLGA与CeO₂/PLGA纳米纤维；以SEM和EDS表征形貌、纤维直径及元素分布，以万能试验机测拉伸性能，以接触角和吸水率评价润湿与吸水，以傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）和差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）分析组成与热行为；以MTT（四甲基偶氮唑盐）法评价人成纤维细胞相容性；采用约300 g Sprague–Dawley大鼠建立全层烧伤模型（Chang Gung Memorial Hospital，IACUC Approval No. 2024062603），设纱布对照、原始PLGA和PLGA/CeO₂组，于第7、28天行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）和Masson三色染色（Masson’s trichrome, MT）组织学分析。

研究结果：
1. 纳米纤维膜表征：通过SEM观察，CeO₂掺入纳米纤维平均直径（159.8 ± 97.6 nm）小于未负载PLGA纳米纤维（267.9 ± 146.3 nm）；研究人员解释为填料降低纤维中聚合物含量，使抗拉伸能力下降并更易伸长。EDS显示强Ce信号及明显O峰，Ce和O空间分布均匀，表明纳米纤维组成均匀且富铈；FTIR在420–510 cm^?1出现Ce–O振动吸收带，DSC中CeO₂约335 °C的吸热特征与PLGA共混后减弱，支持CeO₂成功嵌入PLGA纳米纤维基质。拉伸测试显示CeO₂掺入降低拉伸性能，但两种纤维断裂伸长率均超过50%。接触角分别为未负载PLGA 113.81 ± 5.76°和CeO₂负载PLGA 107.47 ± 6.68°，仅轻微增强亲水性。吸水率随时间增加，PLGA/CeO₂组始终高于纯PLGA：纯PLGA第1周约12%、第2周约17%、第3周约39%，第4周几乎不可见；PLGA/CeO₂第1周约24%、第2周约44%、第3周约58%、第4周约65%。
2. 细胞毒性：通过MTT法评价人成纤维细胞在PLGA/CeO₂基质中的活力，所有纳米纤维均无细胞毒性迹象，各时间点细胞活力不低于对照，超过100%反映28天培养期间成纤维细胞持续增殖；由于CeO₂具有氧化还原酶样活性并可与四唑盐试剂相互作用，研究人员将这些MTT值解释为细胞相容性证据而非绝对活力测量，并计划以正交实验确认。
3. 体内评价与组织学分析：通过大鼠全层烧伤模型观察，第3天和第7天PLGA/CeO₂与纱布组创面收缩相当，第14天起PLGA/CeO₂组愈合肉眼可见优于纱布或商业敷料。创面面积定量显示，PLGA/CeO₂组在第14天和第21天显著优于对照（p < 0.05），第14天显著优于原始PLGA（p < 0.05）；第21天创面面积降至约10%，第28天三组趋近完全闭合且差异不再显著，表明受益主要出现在中间愈合阶段。H&E和MT显示，第7天三组处于炎症向增殖过渡，肉芽组织填充创面床，H&E仅见轻度散在炎症细胞浸润，无脓肿、密集白细胞积聚或组织坏死；MT中对照和PLGA组胶原主要集中于创缘，中央区域淡染少胶原，而PLGA/CeO₂组已在创面床呈现更广泛均匀蓝染，表明更早且更多胶原沉积。第28天进入重塑期，所有组表皮重建、创缘间伤口变窄，PLGA/CeO₂组再上皮化最完整、真皮细胞丰富且有序；MT显示对照组中央仍较淡且胶原松散，PLGA组胶原较密，PLGA/CeO₂组胶原最丰富、致密且均匀分布于全创面。组织学结果与创面闭合加速一致，且无过度炎症或组织坏死，进一步支持良好体内生物相容性。

讨论部分总结：讨论指出，CeO₂治疗多功能性主要源于表面Ce³⁺和Ce⁴⁺可逆互变，使其以催化、自再生方式模拟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性；其抗菌作用主要为正电荷纳米颗粒静电吸附于负电荷细菌膜，破坏膜通透性和跨膜离子转运；抗炎作用与抑制ROS驱动的核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）信号及增强核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2–related factor 2, Nrf2）通路有关；在内皮细胞中还可通过Ref-1/APE1轴稳定HIF-1α，促进血管生成因子分泌。选择PLGA因其水解为乳酸和乙醇酸并经正常代谢清除，降解速率和释放谱可通过乳酸/乙醇酸比例、分子量和端基调控；电纺PLGA纳米纤维模拟天然细胞外基质纤维形貌和高比表面积，提供互联孔隙支持成纤维细胞黏附、迁移和营养扩散；相较降解可长达3–4年的聚己内酯（polycaprolactone, PCL），PLGA以周至月尺度降解，更匹配烧伤炎症和增殖期。设计上，PLGA单独仅提供被动物理屏障，CeO₂单独难以在创面表面长期保留，嵌入电纺纤维可使纳米颗粒随纤维水化和表面侵蚀逐渐暴露，避免一次释放带来的剂量依赖性毒性风险；纤维直径减小与陶瓷填料降低聚合物抗拉伸体积分数一致，吸水增加与亲水陶瓷填料促进液体进入一致，而水渗透是PLGA水解限速步骤；拉伸强度下降被视为刚性非承载填料的预期权衡，因所有纤维伸长率>50%可贴合不规则创面，且未损害生物相容性。与不同载体比较，讨论认为CeO₂内在抗氧化、抗菌和促血管活性可在不同载体中保留，但纤维状细胞外基质模拟架构可能更适合同时提供全层烧伤机械覆盖和细胞引导地形，水凝胶可能在需要更高初始纳米颗粒释放时具优势；第14–21天加速闭合而第28天趋同，与大鼠模型中收缩驱动快速闭合并在终点压缩组间差异的生物学一致，实际益处在于加速修复中期而非改变最终闭合程度。局限包括：未确定不同CeO₂浓度及最优浓度；需研究成纤维细胞生长、细胞排列和炎症调控；大鼠模型与人类在愈合动力学和免疫反应上不同，大鼠以收缩为主而人主要以再上皮化和肉芽组织形成为主，种间差异限制外推；仅28天随访，需长期评价功能恢复、瘢痕质量和感染率；未测CeO₂表面Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原比、CeO₂释放和PLGA降解动力学，未测体内氧化应激标志（如丙二醛、SOD、CAT）、炎症细胞因子（如IL-6、TNF-α、IL-10）和血管生成标志（如CD31、VEGF），故所提抗氧化、抗炎和促血管机制未在本模型直接验证；体内样本量小（每组4个创面），同一动物多个创面可能不完全独立，结果应视为初步，需更大样本、足够把握度和盲法研究，并在适用时采用混合效应模型分析。研究结论翻译：本研究报道了可生物降解的负载CeO₂的PLGA纳米纤维敷料用于烧伤创面的制备和初步体内评价。静电纺丝产生均匀的CeO₂/PLGA纳米纤维，纤维直径减小、具有足够伸长率和良好体外细胞相容性。在大鼠烧伤模型中，负载CeO₂的敷料相对于原始PLGA和对照敷料加速了中间愈合阶段（第14–21天）的创面闭合，尽管到第28天该差异不再显著，因为所有组均接近完全闭合；未观察到不良组织反应。由于未直接测量CeO₂氧化还原状态、释放动力学及体内抗氧化、抗炎和促血管活性，这些结果尚不能因果归因于CeO₂。结果仍支持可吸收CeO₂/PLGA纳米纤维敷料的可行性，并为考虑临床转化前所需的未来机制和剂量优化研究提供了基础。