球形核酸（SNAs）在癌症治疗中的潜在应用：关键观察与见解——聚焦脂质体球形核酸（LSNAs）的癌症免疫治疗

《International Journal of Nanomedicine》：Potential Therapeutic Applications of Spherical Nucleic Acids (SNAs) in Cancer: Key Observations and Insights

　　

摘要 球形核酸（SNAs）是一类独特的核酸纳米治疗制剂，其特征为围绕纳米颗粒核心或分子核心（或无核心纳米结构）紧密排列、呈放射状分布的寡核苷酸。与传统的线性核酸相比，SNAs具有优异的细胞摄取能力、抗核酸酶降解能力，且无需转染试剂即可实现高效的靶标识别。本综述总结了SNAs的结构多样性、设计原理及其所面临的多尺度递送屏障。研究人员主要聚焦于脂质体球形核酸（LSNAs）作为癌症免疫治疗的可编程平台，并强调脂质化学、膜结构及锚定稳定性如何调控淋巴分布、免疫细胞摄取、抗原呈递及强效抗肿瘤免疫，而非将脂质视为惰性载体。此外，研究人员还讨论了当前在基因沉默、基于CRISPR的基因组编辑及刺激响应性多模式治疗方面的进展，重点介绍了SNAs（如临床试验NU-0129）及LSNAs（如cavrotolimod）所取得的显著治疗进展。最后，研究人员阐述了当前面临的转化障碍，以及利用SNAs作为下一代精准免疫治疗药物的潜在前景。 关键词：球形核酸；脂质体球形核酸；肿瘤靶向；癌症免疫治疗；基因调控

主体内容总结

SNAs的演变与结构工程

SNAs主要以其有序的三维（3D）结构为特征，通常由多功能核心及表面高密度修饰的、呈放射状排列的单链寡核苷酸壳层组成。在许多核心锚定型SNA中，表面寡核苷酸长度约为25–40个核苷酸，包含三个功能域：连接基团、间隔区及识别序列。连接基团通常修饰有烷基硫醇、环状二硫化物或其他反应性化学基团，用于将寡核苷酸偶联至纳米颗粒表面。间隔区通常由寡聚乙二醇（OEG）、短poly(T)或poly(A)序列（5–10个核苷酸）组成，用于提高链的柔韧性、减少空间位阻并增强结构稳定性。末端识别序列则设计用于与互补核酸靶标杂交或直接作为治疗性功能单元。

根据核心的性质或有无，SNAs大致分为无机核心SNAs、有机核心SNAs和无核心SNAs。金纳米颗粒（AuNPs）因其高稳定性和易于表面修饰而成为最广泛使用的无机核心。此外，银（Ag）、铂（Pt）、氧化铁（Fe₃O₄）及二氧化硅核心也被引入SNA平台以赋予额外的光学、磁性、催化或治疗功能。然而，部分持久性无机核心SNAs可能在组织中长期滞留，引发生物安全性担忧。有机及软物质核心SNAs通过使用脂质体、聚合物和蛋白质核心扩展了SNA材料的范围。2014年，Mirkin等人报道了首个LSNAs，实现了无需转染试剂的细胞摄取和有效的反义基因沉默。蛋白质SNAs（ProSNAs）通过点击化学将寡核苷酸共价偶联至β-半乳糖苷酶，在皮摩尔浓度下保持酶活性的同时实现约280倍的细胞摄取增强。基于DNA刷状嵌段共聚物（DBBCs）的聚合物SNAs（PSNAs）则提供了可生物降解的支架，具有改善的载药能力和结构灵活性。无核心SNAs包括中空SNAs和基于核酸治疗剂或两亲性核酸偶联物自组装的无载体SNAs，旨在最大化治疗活性组分的比例并消除载体相关毒性。

合成与组装策略

核酸壳层与SNA核心的连接可通过表面共价偶联、非共价锚定、配位或分子自组装实现。对于脂质基SNAs，锚定策略尤为重要，因为它决定了寡核苷酸的保留、表面密度、取向、模式识别受体的可及性及释放动力学。金属-硫醇相互作用可稳健地将硫醇化寡核苷酸锚定至纳米颗粒表面，形成致密的聚核苷酸层。对于缺乏合适金属结合表面的核心，可通过功能连接子或共价反应引入寡核苷酸，包括基于单线态氧可裂解连接子的光敏SNAs、含二硫键和酰胺键的基质金属蛋白酶9（MMP9）响应性肽连接子、EDC/NHS酰胺键形成以及硫醇-马来酰亚胺化学。含脂质核心支持疏水锚定，使胆固醇修饰的引物链直接插入外泌体或脂质体膜。DNA杂交则为预组装组分提供可编程的组织方式。点击化学扩展了可功能化核心材料的范围，包括铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）和无铜的应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）。

癌症中SNAs的多尺度靶向与体内递送

系统给药后，SNAs必须依次克服全身、器官、肿瘤、细胞及亚细胞层面的多重生物学屏障。在血液循环中，SNA的高度有序结构提供静电屏蔽，固有地减少核酸酶结合与降解。然而，血清蛋白可吸附至SNA表面形成蛋白冠，改变颗粒尺寸、表面性质、细胞识别、循环时间和生物分布。PEG化可减轻非特异性蛋白吸附以延长循环时间，但过度的PEG屏蔽可能降低细胞摄取，且重复暴露可能引发抗PEG免疫应答。循环中的SNAs通常通过增强渗透与滞留（EPR）效应相关的外渗进入实体瘤，但致密的细胞外基质、升高的间质液压力和血管周围结合常限制深层组织穿透。对于疫苗制剂，可能需要高效转运至引流淋巴结并被树突状细胞或其他抗原呈递细胞摄取，而非最大化肿瘤组织蓄积。

肝脏和脾脏是纳米颗粒系统给药后常见的蓄积部位。减少非靶器官隔离并改善对其他器官的递送仍是系统给药SNAs的主要挑战。策略包括控制粒径和表面电荷、减少非特异性蛋白吸附、使用可生物降解核心、掺入组织或细胞特异性配体以及选择局部或区域给药途径。主动递送可通过肿瘤微环境响应性激活或受体介导的细胞靶向增强。例如，MMP响应性脂质体SNAs包被两性离子多肽，在MMP丰富的肿瘤组织中裂解并去除保护性涂层，暴露SNA表面，增加肿瘤蓄积和细胞摄取。抗HER2抗体连接的SNAs可被HER2过表达的卵巢癌细胞更快摄取。AS1411适配体功能化SNAs靶向核仁素，叶酸功能化SNAs则促进叶酸受体阳性癌细胞的摄取。

到达肿瘤后，SNAs必须进入靶细胞并将货物递送至适当的细胞内区室。对于多种AuNP基SNAs，寡核苷酸壳层可被A类清道夫受体识别，实现无需额外转染试剂的高效细胞摄取。内化后，SNAs通常通过早期和晚期内体转运，并可能随后在溶酶体中蓄积。因此，高细胞摄取并不一定导致高效基因调控，内体逃逸和受控货物释放是SNA介导治疗的关键屏障。策略包括可电离脂质、膜破坏性肽、pH响应性聚合物以及酶或还原可裂解连接子。所需的细胞内目的地取决于货物类型：siRNA和Cas13主要在胞质中作用，ASOs可靶向胞质或核RNA，而Cas9基因组编辑组分和供体DNA通常需要进入细胞核。

SNAs在癌症中的治疗应用

基因沉默是SNAs的主要治疗应用之一。siRNA-SNAs可有效抑制抗凋亡蛋白、致癌通路和免疫检查点。针对BCL2L12的AuNP-SNAs在体外和体内降低表达、激活半胱天冬酶并抑制胶质母细胞瘤生长。针对Gli1的SNAs可特异性抑制Cyclin D1、c-Myc、BCL2和ABCG2等关键下游靶标。发夹样siRNA-SNAs改善了装载、稳定性和敲低持续时间。ASO-SNAs已单独或与siRNA联合用于调控致癌mRNA、长链非编码RNA（lncRNAs）和microRNAs（miRNAs），包括BCL2、HER2和MALAT1。针对核内保留的lncRNA MALAT1的硫代磷酸酯LSNAs在体外实现了约90%的敲低。金核心ASO-SNAs抑制miR-21和miR-155，在基因与光热联合治疗模型中第35天实现100%存活率。可降解环状刷状SNA递送miR-122在体外和体内抑制肝细胞癌。

基因组编辑提供永久性基因破坏或校正。递送庞大的CRISPR组分本质上比siRNA/ASO递送更复杂。Huang等人开发了预载单指导RNA的Cas9中心ProSNAs，在无额外转染试剂条件下实现32–47%的体外编辑效率。近期CRISPR LNP-SNAs展示了15–68%的插入缺失率（比标准LNPs提高2–3倍）和13–30%的同源定向修复（HDR）效率。Cas9核糖核蛋白（RNPs）也已通过相关AuNP组装递送用于AAVS1和PTEN编辑。核孔复合体限制大于40 nm的完整构建体通过，CRISPR-SNAs可能需要降解并释放编辑货物，或依赖细胞分裂期间的核膜破裂。HDR主要在细胞周期的S和G2期发生，因此在非分裂肿瘤细胞中效率低下。对细菌Cas蛋白的宿主预存免疫可能带来风险，Cas长期活性可能导致脱靶切割。

癌症免疫治疗旨在诱导或恢复宿主抗肿瘤免疫应答。含CpG的SNAs可激活抗原呈递细胞中的Toll样受体9（TLR9），其效力受CpG密度、取向、锚定化学和释放动力学调控。LSNAs作为活性生物纳米颗粒，促进CpG与肽抗原、新抗原或肿瘤裂解物的高密度共呈递，决定树突状细胞（DC）激活和细胞毒性T细胞启动。携带MHC-I和MHC-II表位的多价LSNAs可同时刺激细胞毒性T细胞和辅助T细胞。抗原的结构构型决定所得免疫应答，例如N端偶联、表面杂交的L-SNAs（N-HSNA）比简单混合物诱导约8倍更高的IFN-γ分泌和约2.5倍更强的CD8? T细胞细胞毒性。将胆固醇替换为(C12)9锚可放大IFN-γ产生超过200倍，同时使记忆CD8? T细胞形成和靶细胞裂解加倍。为克服免疫抑制微环境，SNAs将免疫调节与互补疗法协调，如STAT3 siRNA携带的CpG-SNAs同时激活TLR9并抑制免疫抑制信号，阿霉素和CpG装载的LSNAs将化疗诱导的免疫原性细胞死亡与TLR9激活整合。此外，SNAs响应肿瘤微环境（酸性pH、谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、缺氧、酶）或外部刺激（光、超声、辐射）发生结构或功能转变，实现精准时空控制。

SNAs的临床转化：人体试验与里程碑

NU-0129是首个进入人体研究的SNA制剂，在复发性胶质母细胞瘤的早期I期试验（NCT03020017）中评估。该制剂由13 nm金纳米颗粒核心和靶向致癌基因BCL2L12的siRNA致密壳层组成，静脉给药后可穿过完整血脑屏障并在胶质瘤组织中蓄积，触发靶癌蛋白敲低和肿瘤细胞凋亡，且无4/5级治疗相关不良毒性。然而，金属核心在重复临床使用中面临长期滞留和清除问题。为克服这一问题，LSNAs已成为癌症免疫治疗的首选平台。高密度展示TLR9激动性CpG寡核苷酸的可生物降解脂质囊泡cavrotolimod（AST-008）已进入晚期实体恶性肿瘤的早期临床评估。初始I期研究（NCT03086278）证明其在健康受试者中的安全性和免疫激活。cavrotolimod随后进入晚期实体恶性肿瘤（包括梅克尔细胞癌和抗PD-1难治性黑色素瘤）的1b/2期临床试验（NCT03684785），瘤内单独给药或与免疫检查点抑制剂联合给药，通过DC成熟和系统性CD8? T细胞扩增实现免疫激活，且无重金属蓄积风险。Flashpoint Therapeutics的管线包括CpG基TLR9激动剂（FLASH-001，1/2期）、结合抗原和佐剂的疫苗（FLASH-002）以及针对胶质母细胞瘤的脑靶向RNA设计（FLASH-003）。

关键挑战与未来方向

尽管早期临床研究提供了人体内生物学活性的关键证据，但多项挑战仍阻碍SNAs癌症治疗的临床转化。肿瘤递送效率低下且高度可变，EPR介导的蓄积常不一致且不足。致密基质屏障、异常血管和升高的间质液压力严重限制纳米颗粒穿透，脑肿瘤递送面临血脑屏障和血肿瘤屏障的额外障碍。细胞特异性也是主要关注点，肿瘤蓄积增加并不保证递送至所有肿瘤细胞类型。癌症干细胞和治疗耐药克隆可能逃避治疗。体内基因组编辑面临内体滞留、核递送效率低、健康组织中的意外编辑以及低HDR效率等挑战。大规模生产需要严格控制粒径、寡核苷酸密度、载药量和批次间一致性。长期安全性仍不明确，无机核心和质粒可能在体内残留，Cas蛋白可能引发免疫应答，可能发生意外基因组整合或脱靶遗传改变。对于LSNAs，进入细胞后的递送稳定性和货物释放仍需解决。疫苗递送应关注LSNAs能否递送至淋巴结并被DC细胞摄取而非肿瘤蓄积。未来研究应聚焦于具有明确分子组分的可生物降解SNAs，特别是LSNAs。AI辅助设计和高温量筛选可能有助于阐明SNA结构如何影响其活性并指导配方改进。应建立明确标准以评估其质量、安全性和有效性。