壳聚糖-g-P(AA-co-Am)/ZnO纳米复合水凝胶的ZnO负载化学与抗菌、伤口愈合及A172胶质母细胞瘤细胞毒性多功能评价

《International Journal of Nanomedicine》：Synthesis, Characterization, and Multifunctional Applications of Chitosan-Grafted-Poly(Acrylic Acid-Co-Acrylamide)/ZnO Nanocomposite Hydrogel: Loading Studies, Antimicrobial Activity, Wound Healing, and Anticancer Potential

　　

背景：有效的伤口敷料须兼具抗菌作用与组织修复支持。壳聚糖（CS, chitosan）水凝胶具有生物相容性，但抗菌作用较弱；ZnO纳米颗粒（ZnO NPs, zinc oxide nanoparticles）是强效抗菌剂，但需要载体基质。多数研究仅涉及负载化学或生物学性能，较少同时兼顾二者。在此，研究人员将壳聚糖接枝聚(丙烯酸-co-丙烯酰胺)/ZnO纳米复合水凝胶（CH-g-P(AA-co-Am)/ZnO nanocomposite hydrogel）的ZnO负载化学与其生物学行为相联系。

方法：该水凝胶通过自由基接枝共聚（过硫酸钾引发剂、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺交联剂）合成，负载ZnO纳米颗粒，并通过FTIR、XRD、FE-SEM、TEM、AFM、EDX和TGA进行表征。ZnO负载通过批式实验研究。评估了抗菌活性（S. aureus、E. coli、A. niger）、伤口愈合（BALB/c小鼠全层切除伤口；24只动物，四组，每组6只）和细胞毒性（A172胶质母细胞瘤细胞及WRL68参考细胞系，MTT法（MTT assay, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay））。

结果：ZnO纳米颗粒（20–50 nm）均匀分散于网络中；EDX显示锌含量为4.3 wt%，T95%由198.9升至242.1°C。纳米复合水凝胶溶胀率为130.77%。负载符合伪二级动力学（R² = 0.9966）和Freundlich等温线（R² = 0.916），Langmuir模型推导的参考容量为18.35 mg/g。负载为吸热过程（ΔH = +49.19 kJ/mol）但可自发进行（ΔG = ?2.10 kJ/mol），因而为熵驱动，符合Zn²⁺与羧酸基团之间混合物理与配位结合并调控锌释放。纳米复合水凝胶对S. aureus、E. coli和A. niger的抑菌圈分别为24 ± 0.8 mm、22 ± 0.6 mm和25 ± 0.8 mm，第14天伤口闭合率为98.7 ± 1.1%。对A172的半数抑制浓度（IC₅₀, half-maximal inhibitory concentration）分别为94.97（水凝胶）和71.05 μg/mL（纳米复合水凝胶）；相对于WRL68的IC₅₀比值分别为1.79和2.41。由于WRL68为HeLa衍生且ZnO可能干扰四唑盐读数，这些数值表明差异反应，而非肿瘤选择性。

结论：CH-g-P(AA-co-Am)/ZnO纳米复合水凝胶将受控锌负载、抗菌活性和有效伤口愈合整合于一个平台，支持其作为多功能伤口敷料的潜力。

通俗语言摘要：研究人员开发了一种含ZnO纳米颗粒的壳聚糖基水凝胶用于伤口护理。该材料可吸水、抑制有害微生物生长，并促进小鼠伤口更快愈合。实验室检测还显示其对胶质母细胞瘤（一种脑癌）细胞具有活性。这些发现提示该水凝胶可能是未来伤口敷料应用的有前景材料，但临床使用前仍需进一步研究。

研究背景：水凝胶（hydrogel，三维交联聚合物网络）可吸收大量水或生物液体并保持结构完整性，因高含水率、孔隙性和类组织特性而适用于伤口敷料、药物递送和组织工程支架。壳聚糖（CS, chitosan）为甲壳素脱乙酰化得到的线性多糖，具有可降解性、生物相容性、固有抗菌性和止血作用，但原始壳聚糖水凝胶机械稳定性有限且在水相中降解较快。将丙烯酸（AA, acrylic acid）和丙烯酰胺（AAm, acrylamide）等合成单体接枝到壳聚糖上，可形成兼具天然生物相容性、吸水性和机械强度的杂化网络。ZnO纳米颗粒（ZnO NPs, zinc oxide nanoparticles）的抗菌机制包括Zn²⁺释放、活性氧（ROS, reactive oxygen species）生成和细菌膜破坏；Zn²⁺同时作为酶辅因子参与组织修复，但浓度敏感。多数研究只关注负载化学或生物学性能，系统整合纳米颗粒负载动力学、热力学、表面形貌、生物相容性和差异细胞毒性的研究仍不足。因此，研究人员合成并表征CH-g-P(AA-co-Am)/ZnO纳米复合水凝胶，将ZnO负载化学与抗菌、伤口愈合及细胞毒性行为相联系，以评估其作为多功能生物材料平台的潜力。

研究人员通过自由基接枝共聚制备水凝胶并负载ZnO，系统研究负载行为，并开展抗菌、体内伤口愈合和体外细胞毒性评价。结论认为该纳米复合水凝胶成功整合受控锌负载、抗菌活性和有效伤口愈合，支持其作为多功能伤口敷料的潜在应用；细胞毒性结果仅显示两种细胞系的差异反应，不能据此推断肿瘤选择性。

关键技术方法（不超过250字）：采用过硫酸钾引发、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺交联的自由基接枝共聚合成CH-g-P(AA-co-Am)水凝胶，并负载ZnO NPs；用傅里叶变换红外光谱（FTIR, Fourier-transform infrared spectroscopy）、X射线衍射（XRD, X-ray diffraction）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM, field-emission scanning electron microscopy）、透射电子显微镜（TEM, transmission electron microscopy）、原子力显微镜（AFM, atomic force microscopy）、能量色散X射线光谱（EDX, energy-dispersive X-ray spectroscopy）和热重分析（TGA, thermogravimetric analysis）表征。批式负载研究考察剂量、接触时间、温度、pH和初始浓度，并进行动力学、等温线和热力学拟合。抗菌采用琼脂孔扩散法，菌株为S. aureus ATCC 25923、E. coli ATCC 25922和A. niger ATCC 16404。体内采用BALB/c小鼠全层切除伤口模型，24只、四组每组6只，经University of Kerbala伦理批准（UOK.VET.PH.2025.171）。细胞毒性采用A172（ATCC CRL-1620）和WRL68（ATCC CL-48）细胞及MTT法，按ISO 10993-12制备材料浸提液。统计采用单因素方差分析（ANOVA, analysis of variance）、Tukey事后检验和Welch’s t检验，GraphPad Prism 9.5分析。

研究结果：
**水凝胶与纳米复合物的表征（Characterization of the Hydrogel and Nanocomposite）**：FTIR确认接枝共聚成功，ZnO负载后酰胺I带位移并出现Zn–O伸缩振动，提示Zn²⁺–羧酸盐配位；XRD显示ZnO六方纤锌矿衍射峰与聚合物非晶晕共存；EDX显示纳米复合物锌含量4.3 wt%；TGA显示T95%由198.9升至242.1°C，提高43.2°C；FE-SEM和TEM显示ZnO NPs（20–50 nm）均匀分散于多孔基质，少量团聚归因于金属氧化物高表面能；AFM显示ZnO填充表面空隙并改变表面形貌，原文报告扫描区高度范围由17.4降至7.85 nm，同时软件给出纳米复合物Ra和Rq升高，归因于表面嵌入的ZnO NPs。
**溶胀行为研究（Swelling Behavior Study）**：纳米复合水凝胶在蒸馏水中最大溶胀比为130.77%，溶胀容量1.31 g/g，归因于–COOH、–NH₂和–OH等亲水基团；与文献中壳聚糖基网络相比属中等而非超吸水性，作者认为对伤口敷料而言可避免过度溶胀损害机械完整性和黏附性。
**ZnO纳米颗粒负载优化（ZnO Nanoparticle Loading Optimization）**：批式实验显示干样剂量0.05 g时qe最高为2.859 mg/g，预溶胀样在相同条件下qe为14.9 mg/g；接触时间120 min达平衡；伪二级动力学拟合优（R² = 0.9966，qe = 15.67 mg/g，h = 2.088 mg·g^?1·min^?1），Freundlich等温线拟合最佳（R² = 0.916，KF = 1.396，n = 1.787），Langmuir模型给出参考容量18.35 mg/g；热力学参数ΔH = +49.19 kJ/mol、ΔG = ?2.10 kJ/mol、ΔS = +172.04 J·mol^?1·K^?1，提示吸热、自发、熵驱动及混合物理-配位机制；pH由3升至12时负载量由10.62升至17.09 mg/g，但极端pH下ZnO溶解会使UV-Vis法高估表观负载；EDX测得的4.3 wt% Zn约为Langmuir容量对应锌含量的三倍，作者解释为批式实验与生物实验材料制备不同，EDX反映实际用于生物实验的材料锌负载。
**体内伤口愈合评价（In vivo Wound Healing Evaluation）**：BALB/c小鼠全层切除伤口模型中，纳米复合组第3、7、14天闭合率分别为34.2 ± 3.8%、76.5 ± 4.2%和98.7 ± 1.1%，未处理对照组分别为12.8 ± 2.5%、41.3 ± 5.1%和67.4 ± 4.7%，差异显著且效应量大；空白水凝胶组第14天为80.5 ± 3.7%，商业敷料组为86.9 ± 3.1%；第14天纳米复合组近完全闭合并可见毛发再生。作者将加速愈合归因于水凝胶保湿、ZnO抗菌和壳聚糖生物相容性的协同作用；炎症、增殖和重塑期的划分仅为描述性，未进行组织学分析。
**抗菌活性评价（Antimicrobial Activity Evaluation）**：琼脂孔扩散法显示纳米复合物对S. aureus、E. coli和A. niger的抑菌圈分别为24 ± 0.8 mm、22 ± 0.6 mm和25 ± 0.8 mm，优于单纯水凝胶和ZnO NPs，差异显著；革兰阴性E. coli敏感性较低，与其富含脂多糖外膜限制Zn²⁺和壳聚糖链接近细胞质膜有关；作者认为其活性处于未功能化ZnO/壳聚糖复合物的较高范围。
**A172脑癌细胞体外细胞毒性评价（In vitro Cytotoxicity Evaluation on A172 Brain Cancer Cell Line）**：MTT法显示水凝胶对A172的IC₅₀为94.97 μg/mL，对WRL68为169.6 μg/mL，IC₅₀比值为1.79；纳米复合物对A172的IC₅₀为71.05 μg/mL，对WRL68为171.6 μg/mL，比值为2.41；A172存活率在部分浓度显著低于WRL68。由于WRL68为ICLAC登记的HeLa衍生系而非正常对照，且ZnO可能干扰四唑盐读数，作者强调这些结果仅表示差异反应，不能确立肿瘤选择性。
**水凝胶与纳米复合物细胞毒性比较分析（Comparative Analysis of Hydrogel and Nanocomposite Cytotoxicity）**：两种材料对A172的存活率在各浓度均无显著差异（p ≥ 0.08）；纳米复合物在400 μg/mL时对WRL68的存活率显著高于水凝胶（76.89 ± 1.82% vs 71.41 ± 1.10%，p = 0.017）。作者认为二者对A172作用相似，而纳米复合物对WRL68参考系反应更小，支持其首要应用为多功能伤口敷料而非单独抗癌剂。

讨论部分总结：本研究以单一平台整合负载、抗菌、伤口愈合和抗癌细胞毒性评价；与Hussain and Jasim (2021)报道的CH-g-P(AAc-co-Am)水凝胶ZnO负载容量15.2 mg/g相比，本研究为18.35 mg/g；与Khudhair et al (2024)报道的SA-g-P(AAc-co-Am)/ZnO抗菌圈18–20 mm相比，本研究为22–25 mm；第14天98.7%伤口闭合及两种细胞系的IC₅₀比值支持其转化潜力。局限包括UV-Vis负载定量为半定量、需ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱，inductively coupled plasma optical emission spectrometry）验证；体内研究为初步研究，需充分统计效能和组织病理学分析；MTT可能受ZnO干扰，需正交细胞毒性检测；长期降解、Zn²⁺释放动力学和系统毒性尚待研究；ZnO结合模式需zeta电位、零电荷点（PZC, point of zero charge）和X射线光电子能谱（XPS, X-ray photoelectron spectroscopy）直接验证。

研究结论翻译：研究人员通过自由基接枝共聚成功合成了多功能CH-g-P(AA-co-Am)/ZnO纳米复合水凝胶。综合表征确认结晶ZnO纳米颗粒（20–50 nm）均匀 incorporated 于多孔聚合物基质中，热稳定性提高（T95%提高43.2°C），锌含量为4.3 wt%。纳米复合物具有中等溶胀容量（130.77%），ZnO纳米颗粒负载符合伪二级动力学，Langmuir模型推导的参考容量为18.35 mg/g，机制为混合物理-配位相互作用。该纳米复合物通过协同机制对细菌和真菌病原体表现出优越抗菌活性。体内研究显示第14天伤口闭合率达98.7%。MTT评估显示水凝胶（IC₅₀ = 94.97 μg/mL；IC₅₀比值1.79）和纳米复合物（IC₅₀ = 71.05 μg/mL；IC₅₀比值2.41）对A172细胞的细胞毒性均高于对WRL68参考系。由于WRL68为HeLa衍生系且ZnO可能干扰四唑盐读数，这些数值为比较性估计，尚需正交检测和正常脑源性细胞系确认。这些发现确立CH-g-P(AA-co-Am)/ZnO纳米复合物作为伤口敷料和抗菌治疗应用的多功能生物材料平台。