阿尔茨海默病营养与代谢调控背后的海马与下丘脑细胞类型特异性机制

《iScience》：Hippocampal and hypothalamic cell-type specific mechanisms underlying nutritional and metabolic modulation of Alzheimer’s disease

　　

**要点**
• 对5xFAD小鼠海马和下丘脑进行scRNA-seq，并加入或不加入果糖、DHA或NR
• 饮食改变了AD的认知能力以及组织/细胞类型特异性转录组特征
• 果糖增加了脑室上皮细胞的C3表达和小胶质细胞激活，DHA和NR可逆转此变化
• DHA和NR逆转了各细胞类型中与Aβ相关的转录特征

**摘要**

为了解通过调节代谢开发阿尔茨海默病（AD）治疗药物的潜力，我们研究了高果糖摄入作为潜在风险因素，以及二十二碳六烯酸（DHA）和烟酰胺核糖（NR）作为潜在有益因素，对5xFAD小鼠模型海马和下丘脑细胞类型特异性转录组反应的影响。果糖增加了脑室上皮细胞中编码补体成分3的C3表达以及小胶质细胞中的炎症基因，这些变化被DHA和NR正常化。NR和DHA逆转了各细胞类型中与Aβ相关的转录特征，但这些效应受果糖修饰。DHA和NR治疗逆转了AD相关的海马少突胶质细胞减少，其中DHA进一步减少海马小胶质细胞并增加下丘脑星形胶质细胞，而NR进一步增加海马神经元比例。本研究支持代谢调节对AD相关细胞类型和通路的影响，并为利用营养调节剂进行AD干预提供了分子支持。

**引言**

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，截至2026年，美国约有740万老年人受其影响，预计到2060年随着人口老龄化，这一数字将增加至1380万。数十年的研究主要集中于阐明AD两个经典标志——细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）积累和细胞内神经原纤维tau缠结（NFTs）——作为AD发病关键驱动因素的作用。然而，众多聚焦于直接靶向Aβ的临床研究努力以及目前FDA批准的药物产生的益处有限，同时使患者面临相当大的副作用风险。

除Aβ和tau之外的AD发病替代假说包括神经炎症、蛋白质稳态功能障碍、脂质运输缺陷、金属离子稳态失衡和代谢功能障碍。特别是，越来越多的研究强调了2型糖尿病（T2D）与AD之间的强关联，将代谢失调视为AD发展的促进因素。因此，一种高效治疗T2D和肥胖的药物司美格鲁肽（semaglutide）与AD风险降低相关，并正在接受临床试验以评估其在预防AD中的作用；另一种长期使用治疗T2D的药物二甲双胍（metformin）也是如此，尽管结果不一。

饮食是系统和细胞代谢的强大调节剂，已证实与代谢障碍（如T2D和肥胖）及AD相关。例如，高果糖玉米糖浆会导致肥胖、胰岛素抵抗、T2D和痴呆。相反，Omega-3脂肪酸DHA和NAD+前体NR被认为能保护心血管代谢疾病并改善AD患者的认知功能。DHA的多种积极作用，包括改善胰岛素抵抗以及作用于大脑改善突触可塑性、细胞膜完整性和炎症，表明DHA特别适用于防御AD的广泛病理。同样，NAD+协助协调的多种全身和大脑功能，包括能量代谢、DNA修复、表观遗传修饰、炎症和应激抵抗，可能促进AD病理性改变的逆转。

尽管代谢调节与AD风险之间存在关联，但潜在的细胞和分子机制仍未完全阐明。具体来说，AD病理涉及包括神经元、胶质细胞和血管细胞在内的多种细胞类型的相互作用，但单一饮食如何靶向特定细胞类型和分子通路以调节AD发展尚不清楚。为此，我们利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）探究5xFAD模型中海马和下丘脑对Aβ聚集、高果糖摄入（作为代谢综合征的引发因素）以及DHA和NR（作为潜在治疗剂）的细胞类型特异性反应。该模型主要表现出Aβ病理，并显示出快速的AD进展和认知障碍。我们选择海马是因为其在认知和记忆中的关键作用以及其在代谢控制中的新兴作用，选择下丘脑是因为其在代谢稳态中的核心作用。我们的研究主要回答以下问题：(1) 果糖摄入是否加剧与Aβ相关的AD？(2) DHA和NR是否对与Aβ相关的AD提供保护？(3) 饮食干预在AD中调节作用的脑区、细胞类型和分子通路是什么？

**结果**

**DHA和NR缓解5xFAD小鼠中AD和果糖引起的认知及代谢缺陷**

为评估饮食干预对代谢和AD相关表型的影响，我们将5xFAD（缩写为AD）雄性小鼠和遗传背景匹配的B6SJLF1/J对照（WT）随机分配至不同处理组。包括饲喂普通饲料的WT和AD（WT n = 14，AD n = 14）、果糖（WT-F n = 15，AD-F n = 14）、DHA（WT-DHA n = 8，AD-DHA n = 6）、NR（WT-NR n = 7，AD-NR n = 7）、DHA+果糖（WT-DHAF n = 10，AD-DHAF n = 10）以及NR+果糖（WT-NRF n = 10，AD-NRF n = 10）（图1A）。所有饮食从8周龄开始，此时AD小鼠通常表现出明显的淀粉样病理和神经炎症，持续12周。通过Barnes迷宫测试测量的学习记忆显示，AD和AD-F小鼠表现出类似的损伤，而DHA和NR处理改善了AD小鼠的记忆表现（p < 0.05）（图1B）。在AD-F小鼠中，DHA和NR处理与AD饲喂普通饲料相比，记忆改善呈趋势性，但潜伏期差异不显著（分别为p = 0.109和p = 0.064），表明同时饲喂果糖降低了DHA和NR的效力。然而，AD-DHAF相比AD-F显示出显著改善，证明DHA对AD-F小鼠的记忆具有作用。此外，我们在CA1、齿状回（DG）和皮层评估了Aβ斑块负荷（图1D–1F）。Aβ斑块数量（图1E）和斑块面积（占面积百分比；图1F）的模式大体一致。与WT相比，AD和AD-F小鼠在CA1和皮层中的Aβ斑块数量和面积显著增加，但在摄入果糖的组中，皮层斑块面积经DHA和NR处理相比AD组有所减少（AD-DHAF vs. AD-F；AD-NRF vs. AD-F；图1E和1F）。出乎意料的是，与AD小鼠相比，果糖（AD-F）显示出Aβ斑块的非显著减少（图1E和1F）。我们未测量AD-DHA和AD-NR组的Aβ斑块以与AD-DHAF和AD-NRF组进行比较，因此无法推导出果糖对AD小鼠接受DHA或NR治疗时Aβ斑块的影响。总之，这些结果表明补充DHA或NR可缓解AD和/或AD-F小鼠中的认知和Aβ病理缺陷。

**图1 DHA和NR改善学习记忆及葡萄糖耐受性**

(A) 研究设计概述了scRNA-seq中使用的分组、比较、表型测量、样本采集时间表、样本处理和计算分析。
(B) 12、16和20周龄各组BM潜伏期。标注了成对Wilcoxon秩和检验p值。
(C) 8、12、16和20周龄各组IPGTT AUC。标注了成对Wilcoxon秩和检验p值。
(D) 三个脑区选定组的代表性Aβ免疫荧光（绿色）图像。比例尺代表100μm。
(E) Aβ斑块数量定量。
(F) Aβ免疫反应面积定量，表示为Aβ免疫反应占分析区域面积的百分比。对于两种定量分析，每只动物的四个切片测量值取平均生成每只动物的一个值（每组n = 4只动物，另有说明除外）。数据以均值±SEM表示。斑块数量的统计显著性由单因素ANOVA后Fisher最小显著差异（LSD）检验确定。图中显示显著性（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs. WT；& p < 0.05，&& p < 0.01 vs. AD；#p < 0.05 vs. AD-F）。WT，野生型；AD，5xFAD；F，果糖；DHA，二十二碳六烯酸；NR，烟酰胺核糖；DHAF，DHA+F；NRF，NR+F；BM，Barnes迷宫测试；IPGTT，腹腔葡萄糖耐受性测试；AUC，曲线下面积。另见补充图S1。

小鼠的代谢状态通过在12周饮食后进行的腹腔葡萄糖耐受性测试（IPGTT）进行评估，证实果糖损害了WT小鼠的葡萄糖耐受性（图1C）。有趣的是，在8周龄时，饲喂普通饲料的AD小鼠也表现出比WT更差的葡萄糖耐受性（图S1A），这一发现此前未在该模型中报告，可能是受海马和下丘脑等受影响脑区控制的代谢稳态失调所致。在12周龄时，果糖摄入并未进一步损害AD小鼠的葡萄糖耐受性，但AD-DHAF相比AD-F小鼠以及AD-NR相比AD普通饲料小鼠表现出改善的葡萄糖耐受性（分别为p = 0.019和p = 0.032）（图1C）。我们还监测了12周饮食干预期间的体重和体重增长百分比（图S1B–S1E）。在4因素ANOVA分析中（p < 0.05），体重和体重增长均显著受基因型（AD小鼠体重低于WT小鼠）、果糖饮水、时间及多种交互项影响。由于WT和AD小鼠之间存在的差异，我们分别使用双因素ANOVA分析进一步研究了WT组或AD组中不同时间点的果糖饮水和饮食（DHA或NR vs. 普通饲料）对体重或体重增长的影响。我们主要报告AD组的结果，因其具有病理相关性：在AD小鼠中饲喂NR（但不是DHA或普通饲料）时，果糖显著增加体重（图S1C），同时也增强了DHA或NR饲喂AD小鼠的体重增长（图S1E）；NR减少了饮水AD小鼠但不是饮果糖AD小鼠的体重增长（图S1E）。总之，这些发现表明AD小鼠体重降低，且受果糖与DHA/NR处理之间相互作用的调节，而非单独饮食的影响。我们的食物、饮水和热量摄入分析（图S1F–S1H）显示果糖显著增加了饮水和热量摄入，同时减少了食物摄入。总体而言，AD小鼠的认知和代谢功能均发生改变，所有饮食都修饰了这些效应，DHA和NR改善了学习记忆、减少了Aβ病理并增强了葡萄糖耐受性，这些效应不能简单归因于体重和热量摄入的影响。

**scRNA-seq分析揭示5xFAD基因型和饮食调节导致的海马和下丘脑细胞类型丰度变化**

为研究Aβ和饮食（果糖、NR和DHA）对海马和下丘脑细胞类型组成的影响，我们对7组小鼠进行了scRNA-seq，包括WT、AD、AD-F、AD-DHA、AD-NR、AD-DHAF和AD-NRF（每种组织每组n = 3只小鼠，AD组除外n = 6只）（图1A）。组织在5个月龄时采集，此时经3个月饮食饲喂后存在大量Aβ沉积和记忆缺陷，但在6个月开始出现神经元丢失及9个月显著神经元丢失之前。我们获得了通过质量控制的104,378个海马（Hip）和119,581个下丘脑（Hyp）细胞（STAR方法；图S2），并恢复了每种组织的所有主要细胞类型（图2A；表S1）。

**图2 104,378个海马和119,581个下丘脑细胞的聚类及按条件分的细胞类型比例**

(A) 海马（Hip）和下丘脑（Hyp）scRNA-seq转录组谱的UMAP降维及细胞类型注释。
(B和C) Hip（B）和Hyp（C）UMAP按比较的条件细胞注释（上）及欧氏距离分析显示转基因/处理组每个样本的细胞与WT/背景组所有细胞整体基因表达差异的对数倍数变化（logFC）（下）。箱形图中线显示中位数，下铰链和上铰链显示第一和第三四分位数，须显示从铰链的1.5×IQR范围。Benjamini-Hochberg校正后p < 0.05的欧氏距离结果用星号标记。经验p值通过置换方法生成。详见方法部分。
(D) Hip和Hyp中每个样本每个条件下的细胞类型比例，使用scCODA评估比例变化的显著性。

比例变化的显著性用" a "和" b "表示，这意味着" a "组和" b "组之间存在显著差异（如果在同一图中显示两个显著效应，则使用" c "和" d "）。条形代表平均细胞比例值，并标注标准误。细胞类型缩写：小胶质细胞（Mic）、星形胶质细胞（Ast）、少突胶质细胞（Oli）、神经元（Neu）、内皮细胞（Endo1）、少突胶质细胞前体细胞（OPC1）和室管膜细胞（Epen）。比较缩写：AD（AD vs. WT）、F on AD（AD-F vs. AD）、DHA on AD（AD-DHA vs. AD）、NR on AD（AD-NR vs. AD）、DHA on AD-F（AD-DHAF vs. AD-F）、NR on AD-F（AD-NRF vs. AD-F）。组织缩写：海马（Hip）、下丘脑（Hyp）。对于每个组织，每组 n = 3 只小鼠，除 AD 组为 n = 6 只小鼠外。另请参见图 S2 和 S3 以及表 S1、S2 和 S4。

我们首先使用 scCODA（一种贝叶斯统计方法）分析了细胞丰度的变化（表 S2 和 S3）。我们确认了 AD 小鼠与 WT 小鼠在两种组织中均存在显著的小胶质细胞增生；在海马中，小胶质细胞占 WT 的 6% 而占 AD 的 30%；在下丘脑中，占 WT 的 4% 而占 AD 的 15%（FDR < 0.05 具有统计显著性）（图 2D）。AD 海马中的星形胶质细胞和内皮细胞减少（FDR < 0.05），这可能是由于血脑屏障完整性丧失所致，该效应已在 5xFAD 中被观察到。我们还确认了 AD 小鼠在 5 个月大时尚未出现神经元耗竭，这与 5xFAD 中神经元丢失始于 6 个月的报告一致。在两个脑区中，低丰度细胞类型的比例均无显著差异（图 S3）。

我们接着研究了高果糖、DHA 和 NR 对 AD 和 AD-F 小鼠中细胞类型丰度的影响（图 2D）。令人惊讶的是，所有喂食果糖的 AD 组在下丘脑中神经元比例相较于未喂食果糖的组有所增加，而海马中的神经元比例保持不变。果糖促进摄食和释放食欲激素的效应，由下丘脑调控，可能部分解释了这种区域差异。先前的研究报告了果糖处理的 WT 小鼠海马中神经发生降低，但果糖对 AD 模型中神经发生的影响此前尚未报道。DHA 和 NR 主要影响海马细胞比例，其中两者均增加了 AD 小鼠中的少突胶质细胞（NR 对 AD-F 也如此）。NR 还增加了神经元比例，而 DHA 减少了小胶质细胞。DHA 还增加了下丘脑中星形胶质细胞的含量。总体而言，DHA 和 NR 将 AD 中受多种细胞类型的比例恢复到与 WT 相当的水平。

重要的是，观察到的部分细胞比例变化得到了此前使用其他非 scRNAseq 方法研究结果的支持，包括针对 AD 诱导的神经炎症标志物（如小胶质细胞的 IBA1 和星形胶质细胞的 GFAP）以及神经元标志物 NeuN 的免疫组织化学检测，从而减轻了 scRNAseq 中细胞比例偏差的担忧。文献证据支持的细胞比例变化包括：AD 中小胶质细胞增加以及疾病相关小胶质细胞向 Aβ 斑块附近聚集、AD 中星形胶质细胞减少、DHA 和 NR 缓解小胶质细胞和星形胶质细胞激活，以及 NR 的神经元保护作用。

scRNA-seq 揭示 5xFAD 基因型和饮食调节在海马和下丘脑引起的全局转录组显著变化

为了评估 AD 和饮食对各细胞类型的全局转录组变化的幅度和显著性，我们计算了不同组别细胞之间基因表达的欧几里得距离（图 2B 和 2C；表 S4）。与 WT 相比，AD 在许多主要细胞类型中诱导了显著（FDR < 0.05）的转录组变化。在两种组织中，受影响的细胞类型排名最高的是小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。室管膜细胞也是下丘脑中受影响程度最高的细胞类型之一，但在海马中并非如此。AD 在海马或下丘脑中未引起神经元转录组的显著全局变化。

与饲喂标准饲料的 AD 相比，饲喂果糖、DHA 和 NR 的 AD 小鼠在许多细胞类型中也表现出显著的全局转录组变化，其中少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和室管膜细胞在海马和下丘脑中均受到代谢调节的最大影响。在 AD 小鼠中饲喂果糖还独特地影响了下丘脑神经元的转录组。当 AD 小鼠饲喂果糖（AD-F）时，DHA（AD-DHAF vs. AD-F）和 NR（AD-NRF vs. AD-F）对全局转录组的影响在较少的细胞类型中具有显著性，这表明果糖减弱了 DHA 和 NR 对 AD 的转录组效应，正如我们在表型数据中所见。

细胞比例和全局转录组变化分析为我们提供了 AD 和各种饮食及代谢调节剂对细胞影响的收敛和互补观点。两种分析均揭示了 AD 和饮食在小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中细胞比例和转录组变化方面的强烈效应，而果糖诱导的室管膜细胞变化主要通过转录组变化来捕捉。鉴于 DHA 和 NR 在 AD 中表现出对认知和代谢参数的显著改善，AD、DHA 和 NR 改变的重叠细胞类型，即小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和室管膜细胞，可能是其治疗效应背后的主要靶细胞类型。

AD 中反应性胶质细胞基因的上调以及代谢、免疫和溶酶体通路的改变

接下来，我们重点关注受 AD 影响的单个组织和细胞类型中的差异表达基因（DEGs），以阐明分子通路，使用按样本的 DEG 分析将一组中每个样本的细胞与另一组的细胞进行比较，要求在样本之间和批次之间重复 DEG 以减轻 DEG 膨胀并提高可重复性（图 3 和 S4；表 S5）。我们也进行了拟批量 DEG 分析，但检索到的 DEGs 很少（表 S6），支持了拟批量方法过于保守的特性。因此，我们主要报告按样本的细胞水平 DEG 结果。比较 AD 与 WT，我们重现了先前研究报告的 Aβ 反应基因，包括反应性小胶质细胞（也称为疾病相关小胶质细胞或 DAM）基因，如 Apoe、Cst7 和 Trem2，反应性星形胶质细胞基因，如 Gfap、C4b 和 Serpina3n，以及疾病相关少突胶质细胞基因 Serpina3n、C4b、H2-D1 和 H2-K1，在两种组织中均如此（图 3A 和 3B）。海马和下丘脑中的小胶质细胞表现出最多的 AD DEGs，两种组织之间存在显著重叠（Fisher 精确检验 p < 0.05）（图 3C）。除室管膜细胞外，所有海马细胞类型的 DEGs 数量和变化幅度均高于下丘脑细胞类型，这与 AD 动物海马可观察到的更广泛病理一致。

图 3 海马和下丘脑中多种细胞类型的差异表达基因（DEGs）和通路调节

(A) 多种细胞类型、组织和比较中 DEGs 的概述，至少在一个比较中绝对 log2 倍数变化（log2FC）> 1，以检查基因调节的整体模式。log2FC 的大小由颜色强度表示，方向由色调表示（蓝色，下调；红色，上调）。右侧注释了一部分值得注意的 DEGs。

(B) 已知（红色字体和加粗）和特征不详（黑色字体）基因的调节。DEG 变化的着色方式与 A 相同。圆点为调整后 Wilcoxon 秩和检验 p 值（padj）< 0.05 的 DEGs，菱形点为 padj ≥ 0.05 的 DEGs。空心点为在适用比较中 AD 动物的两个批次中 padj < 0.05 且绝对 log2FC > 0.1 的 DEGs。点的大小表示显著性的幅度。

(C) 每种组织中和组织间共享的具有 padj < 0.05 且绝对 log2FC > 0.25 的批次一致（如适用）DEGs 数量。共享列中的暖色强度表示海马和下丘脑之间 DEG 富集的幅度。带星号的共享数字表示通过超几何检验具有显著富集。另请参见图 S4–S9 和 S12 以及表 S5 和 S6。

Fth1、Ctsd 和 Ptgds 是多种细胞类型跨组织中受 AD 影响的基因之一（图 3B）。我们的研究重现了铁储存蛋白铁蛋白的组成部分铁蛋白重链 Fth1 在小胶质细胞和星形胶质细胞中表达升高的结果，并进一步揭示了其在少突胶质细胞和内皮中的上调。编码组织蛋白酶 D（一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶）的 Ctsd 在多种细胞类型中降低，但在小胶质细胞中其表达升高。编码前列腺素 D2 合酶（PGD2）的 Ptgds 在小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中升高。虽然 PGD2 与人类 AD 有关并作为细胞外 Aβ 伴侣蛋白防止其聚集，但 Ptgds 在多种胶质细胞类型中的表达调节此前尚未报道。

在通路水平上，胆固醇稳态、TNFα 通过 NF-κB 的信号传导、溶酶体、p53 通路、氧化磷酸化和翻译是跨多种细胞类型与 AD DEGs 相关的通路之一（图 S4 和表 S7）。AD 中小胶质细胞的通路调节，如胆固醇稳态和溶酶体的上调以及 p53 通路的下调，在海马和下丘脑中相似，反映了总体反应性应答（图 S4–S8）。在其他细胞类型中，脑区之间存在一些通路调节差异，包括海马中星形胶质细胞和神经元溶酶体通路的特异性降低、神经元补体和 p53 通路的降低、OPC1 中氧化磷酸化的增加，以及下丘脑中室管膜细胞糖酵解/糖异生的特异性降低。

DHA/NR 干预逆转了 AD 中与星形胶质细胞反应性和胆固醇稳态相关的基因

DHA 和 NR 下调了 AD 诱导的广泛星形胶质细胞反应性表达的大部分基因（Gfap、C4b 和 Fam107a），并上调了 AD 中降低的基因（Msmo1、Nnat 和 Slc7a11）（图 3B 和 S9F）。果糖维持了与星形胶质细胞反应性相关的 AD 相关基因（与 AD 相比，Gfap、Vim、C4b 和 Serpina3n 的表达变化不显著），但逆转了其他基因（Nnat 和 Fam107a）。DHA 治疗对 AD 下调的胆固醇生物合成的逆转作用最大（图 S5 和 S10），上调了 Hmgcs1、Hmgcr、Msmo1、Sqle、Fdft1 和 Dhcr7 等基因。星形胶质细胞的胆固醇合成和转运对神经元功能和营养支持小胶质细胞很重要，其失调与 APOE4 变异体相关，并可能影响 Aβ 清除。胆固醇也是神经元脂筏的重要组成部分，是 APP 裂解为 Aβ 的优先位点。胆固醇合成基因表达升高对 AD 病理生理学的影响尚不清楚，但 DHA 处理的 AD 动物中改善的记忆表型可能暗示了神经元功能的改善和有利的胆固醇生物合成和水平的恢复。

为了确定星形胶质细胞亚型的组成是否受到营养干预的影响，使用典型相关分析（CCA）将海马和下丘脑星形胶质细胞亚聚类为九个组织和批次整合的簇（图 S9A）。其中，簇 6 和 8 表达了反应性星形胶质细胞基因，包括 Gfap、C4b 和 Serpina3n，但每个簇也有独特的标志物（图 S9C 和 S9D 以及表 S8 和 S9）。没有任何饮食对这些反应性星形胶质细胞簇的比例（图 S9E 和 S9F 以及表 S9 和 S10）或基于 Slingshot 拟时间分析的 AD 中星形胶质细胞轨迹（图 S9E）产生显著影响。

果糖增加但 DHA 和 NR 正常化神经元中与淀粉样前体蛋白（APP）代谢和谷氨酸受体相关的基因表达

在海马和下丘脑神经元中，果糖上调的基因涉及 APP 和溶酶体通路（图 S4、S8 和 S11）。这些包括涉及负向调控 APP 致病性加工和转运的基因（Clu、Sorl1、Itm2c 和 Itm2b）、Aβ 沉积基因（Prnp 和 Rtn3）以及 Aβ 聚集基因（Ache）。上调的溶酶体功能基因包括编码组织蛋白酶的基因（Ctsd、Ctsb、Ctsa 和 Ctsl）、Psap、Gaa 和 Lamp1。LAMP1（溶酶体相关膜蛋白 1）和 PSAP（前神经鞘磷脂酶）尤其已被证明与胞内 Aβ 和 Aβ 斑块共定位。有趣的是，尽管据报道 Aβ 胞内积累在 5xFAD 小鼠中始于 1.5 个月，但这些基因在 RNA 水平上在 AD 与 WT 相比无变化，但被果糖上调，表明果糖可能促使这种负向调控反应。DHA 和 NR 逆转了果糖对海马中 Sorl1、Prnp、Itm2c 和 Itm2c 的这些诱导效应，下丘脑中这些基因无显著变化（图 S11B）。

果糖还增加了神经元中谷氨酸受体的表达（海马中 Gria1，海马和下丘脑中 Gria2 和 Grin1）（图 S11B）。

谷氨酸受体激活已被证明会影响APP加工过程，其中持续激活会增加淀粉样APP加工。在轻度认知障碍中，谷氨酸能突触增加，与对照相比，AD患者死后海马和脑区皮质的谷氨酸受体表达增加。谷氨酸受体水平升高也可能加剧神经毒性兴奋，这与AD相关。DHA和NR处理的AD-F小鼠海马中Gria2表达降低，NR处理的AD-F小鼠海马中Grin1表达降低。总体而言，这些转录变化支持果糖在AD中潜在的促淀粉样效应，以及DHA和NR的相反效应。然而，我们对Aβ斑块的染色并未支持Aβ的显著增加，相反，果糖组呈现下降趋势，这可以用增强的溶酶体功能来解释，但仍需进一步研究。DHA和NR在很大程度上下调反应性小胶质细胞基因，而果糖则增强特定反应性小胶质细胞基因的表达。与AD小胶质细胞反应性相关的基因（如Cd14、Il1b、Gpnmb、Cybb、Wfdc17、Igf1）在DHA和NR作用下得到显著改善，许多稳态基因（如P2ry12、Cx3cr1、Sparc、Selplg、Ecscr、Lpcat2）在DHA和NR作用下上调（图3和S12A）。DHA和NR处理AD及AD-F小鼠后，与翻译相关的基因（Rps、Rpl、Eef）下调，这可能意味着小胶质细胞反应性降低，而果糖则产生相反效果。与对病理反应性降低的潜在作用一致，NR处理的AD小鼠海马和丘脑小胶质细胞中溶酶体基因表达降低（图S4和S8）。尽管DHA主要降低反应性基因的表达，与其已知的抗炎和促消解效应一致，但DHA还增加AD和AD-F背景下的炎症调节因子，包括肿瘤坏死因子Tnf和TNF超家族成员9 Tnfsf9，这逆转了AD相比野生型对Tnf的轻微下调（图S12A）。我们的结果与以往研究不同，此前研究显示DHA可减弱TNF-α诱导的信号传导和TNF水平。然而，人类DHA补充研究显示DHA对TNF水平的影响结果不一致，表明TNF信号在AD和DHA作用中可能具有复杂角色。与DHA和NR相比，果糖也在较小程度上逆转了某些AD小胶质细胞特征（图S13），同时进一步增加海马中反应性小胶质细胞基因Il1b以及海马和丘脑中Gpr84和Man2b1的表达（图S12B）。IL-1β对于维持神经炎症性小胶质细胞状态至关重要，全身炎症已证明可增加小胶质细胞IL-1β，这与果糖诱导的代谢挑战相关，可能导致小胶质细胞处于预激活状态。GPR84参与小胶质细胞增生和小胶质细胞形态改变。Man2b1已被鉴定为Aβ斑块诱导基因，并在Aβ斑块邻近小胶质细胞中上调。利用SCING对海马和丘脑小胶质细胞表达数据进行基因调控网络分析和关键驱动因子分析，识别出跨组比较中富集了小胶质细胞差异表达基因的相互连接的子网络或模块，以及两种组织中的关键驱动因子（图S14和S15；表S12、S13、S14、S15和S16）。海马和丘脑模块显著重叠，反映了跨组织一致的小胶质细胞转录程序（免疫、代谢、溶酶体、细胞周期通路）（图4B和S16；表S17和S18）。海马9与任何丘脑模块均不重叠，包含此前与AD和中枢神经系统损伤相关的小胶质细胞基因（Igsf6、Itga5、Ncstn、Slc23a2、Tex264、Igsf6、Itga5），在AD中显著上调并被DHA下调。NR干预的差异表达基因在位于中心的模块海马3和丘脑2中富集值最高，这两个模块含有最大比例的小胶质细胞反应性基因（Apoe、Trem2、Cd63、Ctsz、Cst7），表明NR可能对小胶质细胞反应性有更广泛的影响（图4C；表S19）。海马3和丘脑2模块还展示了DHA和NR对含或不含果糖的AD的差异化效应（图4C）。在无果糖的AD中，DHA和NR调控相互连接的稳态基因（Csf1r、Selplg、P2ry12、Siglech）并下调Npc2和Cd63。在含果糖的AD中，DHA特异性上调Sparc、Rnase4和Marcks并下调Fth1；NR特异性下调相互连接的反应性基因（Hexa、Fabp5、Tmed3、Spp1、Gusb、Serpine2、Man2b1、Tyrobp、Trem2、Ctsd、Cd52）并上调糖酵解和NADH再生基因（Pkm、Pgk1、Tpi1、Aldoa、Ldha、Gapdh）。果糖影响的基因（Hif1a、Cadm1、Csf1、Serpine1、Serpine2、Apoe、Man2b1、Ldhb、Selplg、Igf1、Lgals3bp）在网络的某一子区域中也相互连接。图4 小胶质细胞Aβ反应和营养影响下的基因调控网络：(A) 海马和丘脑子网络模块中差异表达基因富集。(B) 跨模块富集的顶级通路。A和B中富集p值使用Bonferroni校正的超几何检验计算。(C) 合并的海马3和丘脑2子网络模块（红色），其中含有高比例的显著反应性基因，以强调特定营养干预调控的子区域。另见图S14-S16。对海马（18,370个细胞）和丘脑（10,322个细胞）小胶质细胞进行亚聚类分析和轨迹分析，基于已知标记物识别出1个稳态（H，标记物为P2ry12、Crybb1、Glul）和5个反应性（R1-R5，高表达Fabp3、Igf1、Cd63、Cd68、Ctsz、Cst7）亚群（图5A、5B和5D；表S20和S21）。虽然拟时序推断未显示饮食对小胶质细胞轨迹的显著差异（图5F），但鉴定出小胶质细胞亚型比例的差异。如预期所示，大部分（98%）野生型小胶质细胞为稳态型，反应性小胶质细胞几乎仅存在于AD组中。NR在海马中增加了稳态小胶质细胞的比例（图5C）。R1是一个表达Ifit3、Isg15和Irf7的较小群体，其特征为干扰素相关小胶质细胞，R2和R3簇在转录上类似于"1期DAM"，但也表达独特标记物（R2为Lat2和Olfml3；R3为Tnfaip2、Nlrp3和Itgav）。果糖摄入导致R3比例增加的趋势（图5C；表S22和S23）。R4类似于"2期DAM"，Spp1、Cst7、Itgax、Trem2和Ctsl上调。R5簇呈DAM样，但有独特的基因表达变化，包括某些DAM样基因如Cst7、Cd9和Csf1的下调，其他DAM样基因Apoe、Lyz2和Fth1的进一步上调，以及许多稳态基因包括P2ry12、Cx3cr1、Itgam和Sparc的进一步下调（图5G）。R5还增加了Wfdc17的表达，该基因编码WAP四硫键核心结构域17，也称为激活小胶质细胞/巨噬细胞乳清酸性蛋白（AMWAP），可能作为小胶质细胞促炎反应的对抗调节因子。R5未在此前的小鼠研究中被鉴定，其基因标记物特征（如Apoe上调但稳态及其他DAM基因进一步下调）和与其他DAM簇R2-R4的预测轨迹分歧（图5C）可能表明AD进展中存在一种独特的微胶质细胞状态。与未处理的AD相比，果糖、DHA和NR均降低了R5的比例。图5 小胶质细胞亚型鉴定和反应性轨迹分析：(A) 18,370个海马和10,372个丘脑小胶质细胞的UMAP聚类，按稳态和反应性簇分类，并根据簇、组织和条件进行细胞注释。(B) 顶级亚簇标记基因的表达。注释栏显示细胞的簇、组织和条件。(C) 每个条件的各组织样本中簇比例柱状图，柱代表平均细胞比例值并标注标准误。(D) 每个亚簇的稳态、泛反应性和独特标记基因的特征图。(E) 亚簇标记基因富集的顶级显著通路，具有条件保守的Wilcoxon秩和校正最小p值<0.1。超几何检验Bonferroni校正p值<0.05的富集通路以圆圈表示，大小代表显著性。(F) Slingshot拟时序分析，包括构建的最小生成树和预测轨迹，显示在注释UMAP上（左）。两个轨迹上100个有序时间间隔中每个簇、条件和组织的细胞比例（右）。(G) 按相对于R5簇变化的类别划分的拟时序上示例基因的归一化单细胞表达，以突出两条轨迹之间的差异。每条轨迹绘制了局部回归趋势线。每个组织n=3只小鼠/组，除AD组为n=6只小鼠。果糖加剧AD对脑膜细胞C3信号向小胶质细胞的促进作用，而DHA和NR则显示C3信号下调。在比较AD影响与饮食因素影响之间的基因和通路时，我们鉴定出脑膜细胞中的C3信号作为另一个汇聚点。C3编码补体成分3，是补体级联的核心调节因子，与AD具有功能关联。在AD小鼠模型中，C3被证明是神经退行性变所需的，其缺失可保护神经退行性变，C3介导的裂解性膜攻击复合物驱动突触丢失。在AD患者中，C3蛋白在脑和脑脊液中升高，与tau蛋白相关，且C3在人类AD大脑中S-亚硝基化增加，在女性中效应更强。在我们的研究中，AD特异性地增加了海马中脑膜细胞的C3表达（图6A）。果糖进一步上调海马中的C3表达，并在丘脑中稳健诱导，表明果糖加重了补体激活。相比之下，DHA在海马和丘脑中稳健下调AD相关的C3升高，降至几乎不存在的水平，甚至低于野生型水平，表明DHA可能具有免疫消解效应（图6A）。DHA和NR均缓解了果糖诱导的丘脑脑膜C3上调，NR还进一步逆转了果糖加剧的海马C3表达。图6 脑膜细胞和C3应答细胞中果糖、DHA和NR对C3表达和相互作用的影响：(A) 脑膜细胞（上）和星形胶质细胞（下）中C3的归一化表达（左）及差异表达（右）。(B) 以脑膜细胞为来源、小胶质细胞为受体，由LIANA推导的顶级配体-受体相互作用。SingleCellSignalR配体-受体互作评分相对于相应背景的变化以色块填充表示。(C) C3受体和靶标在潜在应答细胞类型中的差异表达。差异表达图如3B所述。另见图S17和表S24和S25。脑膜细胞中果糖对C3表达的稳健诱导可能与小胶质细胞亚簇R3相关（图6），果糖在AD中加剧了反应性小胶质细胞基因Il1b和Gpr84的增加表达（图S12B），R3标记基因富集于"纤维蛋白补体受体3信号通路"（图5E）。利用NicheNet进行的细胞-细胞通讯分析表明，与其他条件相比，喂食果糖的AD小鼠丘脑小胶质细胞中C3的配体活性更高，这基于果糖诱导的小胶质细胞差异表达基因中C3的靶标（图S17A和表S24）。SingleCellSignalR配体-受体互作分析显示，DHA降低了脑膜细胞（C3作为配体）与小胶质细胞（Itgam、C3ar1、Cd81、Lrp1、Itgax和Nrp1作为受体）之间的互作评分（图6B和表S25）。许多C3受体和下游靶基因在AD中改变，并被饮食进一步调节（图6C）。尽管C3据报道可由星形胶质细胞等胶质细胞分泌，尤其是Liddelow等人的"A1星形胶质细胞"，但反应性星形胶质细胞scRNA-seq研究中C3表达的证据以及C3在神经退行性变中星形胶质细胞差异表达的证据薄弱。实际上，在我们研究的30,036个星形胶质细胞中，AD未调控C3，C3仅在0.9%的星形胶质细胞中表达，但在海马和丘脑所有条件下的60.2%脑膜细胞中表达（图6A）。与此一致，此前的scRNAseq研究对自身免疫介导的神经炎症小鼠模型中按C3表达从全脑分选细胞，发现C3表达的脑膜细胞回收率高于星形胶质细胞。我们的结果表明，在神经病理部位观察到的高C3水平可能更多来自脑膜细胞而非星形胶质细胞的贡献。AD和饮食调控的差异表达基因富集了人类AD的遗传风险因子。为了解我们研究中鉴定的差异表达基因对人类AD的相关性，使用Mergeomics流程中的标记集富集分析（MSEA）确定差异表达基因对六种不同人类AD GWAS信号的富集（Jun et al.、UK Biobank、Kunkle et al.、Jansen et al.、Schwartzentruber et al.和Bellenguez et al.）（图S18）。

我们首先将GWAS单核苷酸多态性位点（SNPs）映射到候选基因（图S14），使用50千碱基对的染色体距离，然后评估了本研究中哪些小鼠差异表达基因（DEG）集合显示出与阿尔茨海默病（AD）相关GWAS基因的显著富集（表S26）。AD模型中小胶质细胞的AD DEGs、星形胶质细胞和内皮细胞的DHA DEGs，以及在AD和果糖模型中来自海马和下丘脑组织的内皮细胞、神经元和血管平滑肌细胞的DHA DEGs，在不同AD GWAS研究中均表现出一致的显著富集。在不同疾病或饮食条件、细胞类型和组织中共同贡献富集的DEGs包括APOE、CLU、TSC22D4、APP、GPX4、ALDOA、CCDC85B和CRIP1（图S15）。

在海马和下丘脑之间，小胶质细胞、神经元和内皮细胞DEGs的富集模式存在差异。对于下丘脑，与小胶质细胞的所有营养干预DEGs相比，除了AD-F模型中NR的DEGs外，在所有AD GWAS研究中均表现出一致的富集。下丘脑小胶质细胞DEGs更强的富集模式可能归因于（1）下丘脑小胶质细胞中有更多的果糖、DHA和NR DEGs，以及（2）映射到高度显著GWAS信号的DEGs中包含APOE、APOC4和BIN1。相反，对于海马，来自AD、DHA处理AD-F和NR处理AD-F的神经元DEGs表现出一致的AD GWAS富集。贡献这些海马神经元特异性富集的基因包括SORL1（AD、F处理AD、DHA处理AD-F和NR处理AD-F）、SNRPD2（AD、NR处理AD-F）、GEMIN7（NR处理AD-F）、PSMC6（NR处理AD-F）、CACNA2D3（NR处理AD-F）和CLPTM1（F处理AD）。在各种条件下，海马内皮细胞DEGs比下丘脑内皮细胞DEGs更一致地富集AD GWAS。在贡献GWAS信号富集的海马内皮细胞DEGs中，ENC1被发现与认知韧性有关。在不同饮食之间，DHA处理AD-F的DEGs相比其他条件产生了更多的AD GWAS富集，这主要是由APOE和CTSB等显著DEGs驱动的。

我们对AD GWAS和AD模型及饮食影响的DEGs进行整合，为特定细胞类型、组织和饮食在AD风险调节中的人类相关性和功能作用提供了支持。

讨论

尽管已经观察到AD中的代谢功能障碍，但在细胞和分子水平上对代谢调节因子在AD中作用的理解尚未实现。本研究是首次检查和比较果糖、DHA和NR对5xFAD小鼠在调节认知（海马）和代谢（下丘脑）的核心脑区中转录特征的影响，并以单细胞分辨率进行分析。我们再现了5xFAD反应特征，并发现DHA和NR在海马和下丘脑中有显著的逆转，同时在DHA和NR处理的AD小鼠中改善了记忆力和AD病理，很可能表明病理缓解。通过调查两个对AD病理至关重要的脑区中的所有细胞类型，我们的研究揭示了大量与AD和饮食效应相关的细胞类型、基因和通路的重要性。特别是，我们强调了小胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞和神经元及其各自组织背景在饮食调节AD中的作用。

先前的研究已观察到果糖在非AD模型中诱导神经炎症和认知功能损害。然而，在5xFAD模型中，我们发现果糖的影响不那么明确。一方面，我们揭示了果糖可能通过哪些潜在的细胞类型水平机制来加重AD病理。在神经炎症方面，我们发现了某些AD相关小胶质细胞基因的加剧，包括Il1b，室管膜细胞中C3表达增加，以及神经元中Cx3cl1表达增加，后者编码fractalkine，与神经炎症有关，并在轻度认知障碍（MCI）和AD患者的脑脊液和血液中升高。此外，果糖相关的小胶质细胞DAM亚型R3显示出参与C3受体信号通路的基因富集，这可能是由果糖引起的室管膜细胞中C3上调所影响的，并可能代表果糖诱导的全身性代谢综合征加剧小胶质细胞反应性和神经退行性变的一条途径。我们还发现果糖上调了参与APP和溶酶体通路的基因，并增加了神经元中谷氨酸受体的表达，表明神经毒性过度兴奋，从而增加了淀粉样蛋白APP加工。此外，果糖降低了神经元中的氧化磷酸化基因，表明神经元生物能量受损。重要的是，所有这些效应都被DHA和/或NR逆转了。这些转录变化支持了果糖在AD中潜在的促神经炎症和促淀粉样蛋白作用，以及DHA和NR针对这些细胞类型和机制以减轻疾病的效应，正如我们在之前的AD模型研究中所观察到的。

尽管上述证据支持果糖在AD中可能有害的作用，我们也注意到果糖诱导了许多看起来有益的变化，例如与无果糖的AD相比，Aβ沉积呈减少趋势（图1E和1F），喂食果糖组中神经元比例显著增加（图2D），在许多DEGs中与DHA或NR一致（图3），以及DAM样小胶质细胞R5下调（图5G）。因此，果糖对AD的影响是微妙的，需要进一步深入探索。

DHA被广泛认为是改善代谢缺陷、维持神经元完整性和减少炎症的。由于我们的研究中DHA并未改善葡萄糖耐量，DHA在我们的研究中逆转AD效应可能主要源于其在大脑中的作用，而非对全身代谢的作用。DHA的抗炎效应在我们的研究中得到了支持，表现为室管膜细胞中C3表达的显著下调，以及小胶质细胞和星形胶质细胞中胶质反应性基因表达降低。DHA还增加了下丘脑星形胶质细胞比例和参与胆固醇合成基因的表达，后者是星形胶质细胞的关键功能。与这些结果一致，DHA已被证明可以增加星形胶质细胞的分化和反应性星形胶质细胞增生。我们确实观察到下丘脑Aqp4表达增加（表S5），这与星形胶质细胞分化有关，参与血脑屏障和脑脑脊液屏障的水平衡以及突触传递。在人类AD中，对Aβ和tau病理易感的区域中胆固醇合成基因表达降低。DHA诱导的星形胶质细胞胆固醇合成基因表达增加表明，恢复星形胶质细胞胆固醇稳态——这对于神经元功能、小胶质细胞支持和Aβ清除至关重要——在AD缓解中发挥作用。

先前的AD模型中NAD+补充研究已发现减少DNA损伤、降低神经炎症以及支持线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）是潜在的有益效果。在我们的NR补充研究中，我们没有观察到参与DNA修复或线粒体应激反应基因表达的明显变化，但我们观察到下丘脑室管膜细胞中Hspa5、Hspa8、Hspa1a和Rack1增加，这些基因参与内质网应激反应和UPR。我们的结果还表明NR的潜在疾病缓解效果包括改善神经元氧化磷酸化和生物能量学，以及减少小胶质细胞和星形胶质细胞的反应性和炎症。

虽然我们预期果糖的效应大体上与DHA和NR相反，但我们也观察到在所有三种条件下某些基因和通路的变化方向相同，包括AD特征的逆转。实际上，我们的小胶质细胞网络模型表明，饮食调节的子网络高度相互关联。有可能果糖除了其有害效应外，还能激活某些保护性通路，如DHA和NR激活的通路，这可能解释了AD-F与AD小鼠相比，记忆缺陷和Aβ病理得以维持但未恶化的现象。

虽然海马小胶质细胞在AD中已被广泛研究，但下丘脑小胶质细胞仍研究不足。通过对28,705个海马和下丘脑小胶质细胞的亚聚类，我们能够确认两个组织之间已知小胶质细胞亚型的高度一致性，并将小胶质细胞激活扩展到AD的下丘脑。更重要的是，我们在5xFAD模型中鉴定了一个新的DAM样簇R5，它具有独特的转录谱和从经典DAM簇的轨迹，其特征是稳态小胶质细胞基因进一步下调，以及特定反应性基因的下调和进一步上调的混合。R5可能与人类AD中描述的小胶质细胞更一致，后者通常来自晚期尸检组织，除了APOE等某些基因外，并未再现小鼠的多个DAM基因，而在R5中APOE进一步增加。与AD相比，所有饮食均减少了R5小胶质细胞，表明这种DAM亚型对代谢调节具有高度敏感性。一个遗留问题是饮食是简单地抑制了R5还是将R5逆转回稳态（H）小胶质细胞。由于H和R5两个簇的比例均被饮食降低（图5C），且我们的轨迹分析未显示R5向稳态小胶质细胞的逆转（图5F；轨迹2），因此不太可能是饮食将R5逆转回H。未来需要谱系追踪实验来直接解决这一问题。

在海马和下丘脑之间，尽管胶质反应性程序被一致再现，但海马在星形胶质细胞和少突胶质细胞中表现出更大的激活，而两个组织显示出相似的小胶质细胞激活。这可能表明星形胶质细胞和少突胶质细胞反应性在Aβ病理更严重的区域（如海马）更强，而小胶质细胞反应性的强度与病理严重程度关联较小。有趣的是，即使在9个月时，5xFAD小鼠的下丘脑中尚未观察到Aβ斑块。因此，我们在5个月时观察到的下丘脑小胶质细胞激活并非由局部Aβ斑块引起，而可能是对其他脑区应激信号或AD中代谢失调的反应。

室管膜细胞在AD的单细胞研究中通常不被报告，尽管它们在维持血脑屏障和脑脑脊液屏障、调节中枢神经系统分子平衡、免疫细胞和废物清除方面的重要性，而这些在AD中是失调的。在我们调查中观察到的最显著的营养效应之一是果糖、DHA和NR对C3表达的调节。最值得注意的是，果糖诱导下丘脑C3表达并加剧海马C3表达，而DHA处理的AD在两个脑区均显著降低C3表达。在代谢障碍中也已观察到补体激活，其中升高的血糖和果糖增加晚期糖基化终末产物，可直接激活补体或抑制补体膜攻击复合物（MAC）组装的抑制剂。此外，在一项纵向研究中，血浆C3水平与胰岛素抵抗和2型糖尿病发病率相关，再次支持了代谢-补体之间的联系。最后，我们观察到室管膜细胞和小胶质细胞（C3的主要应答者）之间C3受体评分增加。IL-1β已被证明是通过补体介导的NLRP3炎症小体激活，经caspase-1切割释放的。在我们的研究中，小胶质细胞中Il1b和Nlrp3的表达也被果糖增加，进一步表明室管膜细胞来源的C3影响小胶质细胞中Il1b和Nlrp3的表达。综合来看，我们的发现支持了室管膜细胞在神经炎症中先前未被充分探索的作用，在我们代谢挑战模型中这一点尤为值得关注，因为室管膜作为外周与中枢神经系统之间的界面，可能介导全身代谢对神经炎症的影响。

我们对果糖、DHA和NR在记忆和代谢调节两个重要脑区中转录组效应的单细胞研究揭示了AD和饮食效应背后的关键细胞类型、基因和通路。除了确认免疫和代谢通路在小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中的既定作用外，我们的发现还提供了新的见解，如室管膜细胞在介导AD和饮食调节中代谢对神经炎症贡献的未被充分研究的作用，新的DAM样R5，以及下丘脑作为代谢控制中心在AD背景下的关键作用。我们将小鼠发现与人类AD GWAS进行整合，确认了选定细胞类型及其DEGs与人类AD潜在因果机制的相关性。

研究局限性

本研究的局限性包括scRNA-seq样本量低（n = 3–6/组）、仅检测雄性小鼠、仅在基因表达水平探索分子机制而缺乏功能和因果验证，以及使用Aβ沉积AD模型，该模型未能捕捉AD的所有方面，也不代表晚发型AD的潜在病因。

未来的研究应在其他两种性别的AD模型（如tau蛋白病小鼠模型以及同时具有Aβ斑块和神经纤维缠结的3xTg模型）中进行，并对优先细胞类型、基因和通路进行功能靶向研究，以评估我们发现的普适性和因果性，这是值得开展的。

资源可用性

通讯作者

更多信息及请求应联系通讯作者杨霞博士（[e-mail]），将由其负责处理。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据与代码可用性

• 原始scRNA-seq数据fastq及基因表达计数矩阵已存于GEO数据库，登录号为GEO: GSE292341。
• 本文未报告原创代码。
• 重新分析本文所报告数据所需的任何额外信息，均可向通讯作者索取。

致谢

本研究得到NIH/NIDDK R01 DK104363项目资助，项目编号授予XY及FGP。感谢Russell Littman、Irika Sinha、Pancy Pan、Alanna Johnson Stewart及Ayaka Sugeno在计算分析方面提供的协助。图形摘要由BioRender制作。

作者贡献

X.Y.、F. G.-P.及J.D.构思了研究创意。J.D.起草了论文初稿。J.D.、X.Y.、S.S.W.及D.S.对论文进行了审阅和编辑，全文经所有作者批准。Z.Y.和V.P.-S.进行了饮食和行为实验。I.S.A.和G.D.完成了scRNA-seq实验。J.D.和D.S.完成了生物信息学分析。J.D.、S.S.W.及Z.Y.制作了图表。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 抗体 | anti-β-Amyloid 6E10抗体 | BioLegend, Cat# 803001; RRID: AB_2564653 |
| 生物样本 | 5xFAD（背景：B6SJLF1/J）和B6SJLF1/J雄性小鼠的海马和丘脑 | 本研究, N/A |
| 关键商业试剂 | Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics, Cat# 100121 |
| 二十二碳六烯酸（DHA） | Nordic Naturals, Inc., N/A; 补充膳食成分 |
| 烟酰胺核糖核苷（NR） | ChromaDex, N/A; 补充膳食成分 |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington, Cat# LS003119 |
| 存档数据 | 原始单细胞RNA测序fastq及原始基因表达计数矩阵 | 本研究，基因表达综合登录号：GSE292341 |
| 实验模型：生物体/品系 | B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1?M146L?L286V)6799Vas/Mmjax (5xFAD) 雄性 | Jackson Laboratory, MMRRC品系#034840-JAX |
| | B6SJLF1/J | Jackson Laboratory, 品系#:100012 |
| 软件与算法 | CellRanger 3.0.2 | 10x Genomics, N/A |
| | Seurat R包 4.3.0 | Butler et al., https://satijalab.org/seurat/ |
| | scCODA 0.1.7 | Büttner et al., https://github.com/theislab/scCODA |
| | SCING | Littman et al., https://github.com/XiaYangLabOrg/SCING |
| | Mergeomics 1.24.0 | Shu et al., https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Mergeomics.html |
| | Slingshot 2.4.0 | Street et al., https://github.com/kstreet13/slingshot |
| | NicheNet 2.2.0 | Browaeys et al., https://github.com/saeyslab/nichenetr |
| | LIANA 0.1.14 | Dimitrov et al., https://saezlab.github.io/liana/ |
| | Graphpad Prism 11 | GraphPad, https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| | BioRender | BioRender, https://www.biorender.com/ |

实验模型与研究参与详情

小鼠

B6SJLF1/J背景的雄性5xFAD小鼠购自Jackson Laboratory（MMRRC品系34840）。雄性B6SJLF1/J小鼠作为对照。共包含十二个不同条件组：(1) 对照/野生型常规饲料喂养（WT, n = 14），(2) WT高果糖喂养（WT-F, n = 15），(3) WT DHA喂养（WT-DHA, n = 8），(4) WT NR喂养（WT-NR, n = 7），(5) WT高果糖加DHA喂养（WT-DHAF, n = 10），(6) WT高果糖加NR喂养（WT-NRF, n = 10），(7) 5xFAD常规饲料喂养（AD, n = 14），(8) 5xFAD高果糖喂养（AD-F, n = 14），(9) 5xFAD DHA喂养（AD-DHA, n = 6），(10) 5xFAD NR喂养（AD-NR, n = 7），(11) 5xFAD高果糖加DHA喂养（AD-DHAF, n = 10），(12) 5xFAD高果糖加NR喂养（AD-NRF, n = 10）。食用高果糖的小鼠饮水中果糖浓度为15%（w/v）。该剂量是基于C57BL/6小鼠的既有研究先例选择的，该浓度可可靠地诱导出代谢功能障碍的标志性特征，包括糖耐量异常和血脂异常，而不会混淆体重增加和热量摄入，从而将果糖驱动的代谢效应与肥胖相关机制分离开来。15%的浓度摄入量大致相当于60公斤成年人在1至2升苏打饮料中长期每日摄入130克糖，保持了与人类膳食暴露模式的转化相关性。DHA（1.2% w/w；Nordic Naturals, Inc., Watsonville, CA, USA）和NR（3.6 g/kg饲料；ChromaDex, Los Angeles, CA, USA）补充剂混合到常规饲料中。由于分组和小鼠数量庞大，分两批在两年内获取小鼠。第一批包含WT、AD、AD-F、AD-DHAF和AD-NRF组，第二批包含AD、AD-DHA和AD-NR组，其中共同的AD组作为批次间的比较锚点。我们在每个批次内分别分析数据。饮食干预从8周龄开始，持续12周。在8、12、16和20周龄时进行腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT），在12、16和20周龄时使用Barnes迷宫测试学习记忆表型。对WT、AD、AD-F、AD-DHAF和AD-NRF组进行Aβ免疫荧光定量。所有动物实验均按照UCLA动物护理与委员会（IACUC）批准的方案ARC-2012-059进行。

方法详情

免疫荧光

取脑并迅速分离为左右半球。一侧半球包埋于OCT复合剂中，在干冰上冷冻，储存于?80°C。使用冷冻切片机（LEICA CM1900）制备冠状脑切片（10 μm厚度），并贴于Superfrost Plus载玻片（Fisher Scientific, 12-550-15）上。

免疫荧光染色中，脑切片先在4%多聚甲醛中固定30分钟，然后用PBS洗三次（每次10分钟）。切片随后在含0.3% Triton X-100和5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭/通透液中选择孵育1小时，接着用PBS洗一次（10分钟）。切片在4°C下与小鼠抗Aβ抗体6E10（1:500；Bio Legend, San Diego, CA, USA; 803001）过夜孵育。三次PBS清洗（每次10分钟）后，切片用Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（1:200；Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; A-21202）孵育1小时。随后切片用PBS洗三次（每次10分钟），并加入Hoechst 33342（10 μg/mL；Invitrogen; H1399）孵育10分钟。最后一次用PBS洗10分钟后，切片风干，并用Permafluor封片剂（TA-030-FM; Thermo Fisher Scientific）封片。

荧光图像使用荧光显微镜（Carl Zeiss）采集。使用ImageJ定量Aβ斑块数和Aβ免疫反应面积。每只动物分析3至4个图像，取测量值的平均值生成每只动物的单一数值用于统计分析。Aβ免疫反应面积以Aβ免疫反应占分析区域的百分比（% area）表示。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）

对WT和所有AD组的海马和丘脑进行基因表达谱分析（WT、AD-F、AD-DHA、AD-NR、AD-DHAF和AD-NRF组各n = 3；AD组n = 6），共计24只小鼠和48个生物学样本。使用木瓜蛋白酶消化新鲜解剖的海马和丘脑组织。按照Brewer等人描述的方案将细胞悬浮，最终浓度为0.04% BSA-PBS中1000个细胞/μL。scRNA-seq使用10x Genomics平台（10x 3′单细胞RNAseq V3试剂盒）在UCLA基因组与生物信息学技术中心（TCGB）进行。样本随后在Novaseq S2上以2 × 50bp设置测序，覆盖度约为50k read/cell。

10x genomics数据预处理与质量控制

将reads比对至mm10基因组，并使用CellRanger软件（v 3.0.2）（10x Genomics）计算基因计数。将各文库的过滤后特征-条形码矩阵加载至Seurat（v 4.3.0）[https://github.com/satijalab/Seurat]中，合并创建WT、AD、AD-F、AD-DHA、AD-NR、AD-DHAF和AD-NRF七个不同的合并数字基因表达矩阵。我们发现存在显著的游离RNA污染，因此使用CellBender通过remove-background功能获得校正后的计数矩阵。然后根据以下阈值筛选单细胞：至少100个基因和500条转录本，且低于25,000条转录本、15%线粒体基因表达、1%血红蛋白基因表达，以及5%的Gm42418和AY036118表达（rRNA污染）。每个细胞的转录本计数按该细胞的总表达量进行归一化，数值乘以10,000并进行对数转换（LogNormalize）。在亚聚类分析中，我们观察到更多低质量细胞，如Malat1表达极低的细胞，我们推测这些是核减少的细胞，并移除了这些细胞。我们还移除了Gm42418和AY036118高表达的亚聚类。

细胞聚类与注释

使用Seurat，通过均匀流形近似与投影（UMAP）将细胞投影至二维空间，并使用Louvain聚类进行聚类分配。使用Seurat中的FindConservedMarkers确定各样本间一致的细胞簇特异性标记基因，该功能采用非参数Wilcoxon秩和检验，在每个样本内分别运行并计算跨所有样本的元p值，以评估每个基因对各簇的特异性。对每个样本，分析在聚类中所有细胞与其他所有细胞之间运行。测试的基因必须在某一组中至少5%的单细胞中有表达。这些标记基因经人工评估是否汇聚于已知的脑细胞类型标记基因，并据此对细胞类型进行标注。

全局转录组变化的定量评估

对于每种细胞类型，我们通过计算每个实验组和对照组内该细胞类型所有基因的平均表达量，为每个配对比较（AD vs. WT、AD-F vs. AD、AD-DHA vs. AD、AD-NR vs. AD、AD-DHAF vs. AD-F和AD-NRF vs. AD-F）生成样本分层的实验组代表细胞和对照组代表细胞。然后计算这些代表细胞之间的基因表达欧氏距离，以量化实验组对每种细胞类型的影响。为确定各细胞类型中组间欧氏距离的显著性，我们通过从两组中随机抽取该细胞类型的细胞并计算其欧氏距离来估计零分布。此置换方法共重复1000次以生成零分布，并将其与从真实实验组和对照组比较中生成的欧氏距离进行比较，以确定经验p值。为校正所有测试细胞类型的多重检验，我们使用Benjamini-Hochberg校正计算校正后的p值。实验组各样本与对照组的比较结果必须校正p值<0.05才能判定为"显著"转录组变化。

差异组成丰度分析

使用scCODA评估细胞类型丰度变化的统计学可靠性，该方法结合Dirichlet-多项式模型和尖刺板先验，生成协变量对每种细胞类型影响的贝叶斯模型。具体评估了以下协变量对海马和丘脑细胞类型的影响：基因型（AD vs. WT）、饮食（F处理、DHA处理、NR处理：是vs. 否）、组别（例如，AD-DHA vs. 所有其他组），以及处理后的AD（例如，AD-NRF vs. AD）。效应量相对于自动选择的参考细胞类型确定，该参考细胞类型的丰度受协变量影响最小。随后进行Hamiltonian蒙特卡洛采样推断，获得截距（即无活性协变量时的丰度）和活性协变量效应的最终参数。使用一系列目标FDR阈值（从0.01到0.25，以0.05为增量）确定每种细胞类型-协变量组合的非零最终参数（即统计学显著效应）。

差异基因表达（DEG）分析

使用Seurat中的FindMarkers功能比较实验组和对照组之间的基因表达以识别差异表达基因（DEGs）。FindMarkers功能基于与FindConservedMarkers相同的分析方法（非参数Wilcoxon秩和检验）。我们使用绝对平均log2倍数变化（log2FC）大于0.25且校正p值小于0.05的阈值来筛选DEGs。对于包含AD组的比较（该组在两批中均有重复），基因必须在两批中均持续显著（校正p值<0.05且绝对log2FC > 0.25）才能被判定为DEGs。此外，我们还运行了样本级DEGs，即对每组每个样本分别与另一组的所有细胞进行FindMarkers分析，并使用Wilcoxon秩和检验的p值计算元p值。此方法未用于额外筛选DEGs，但样本一致的结果被用于聚焦特定基因在论文中进行可视化和讨论。对于观察到部分样本转录本计数较低的神经元群体，我们使用SCTransform v2校正（来自Seurat）的计数获得DEGs。此外，我们还使用DESeq2进行了拟批量DEG分析，但由于该方法过于保守，揭示了少量DEGs。

我们重点报告细胞水平差异表达基因（DEG）的结果。

基因调控差异表达基因的通路富集分析
满足校正p值阈值0.05和平均log2FC绝对值阈值0.1的差异表达基因，且在适用的情况下在两组AD动物批次间表现一致，用于通路富集分析。通路来自KEGG、BioCarta、Reactome、Gene Ontology生物学过程、Hallmark和Wikipathways基因集，这些基因集来源于Molecular Signatures Database（MSigDB）。分析前需使用biomaRt将小鼠基因转换为人类基因。通路的显著富集基于超几何检验，随后采用Bonferroni方法进行多重检验校正。超几何检验中的背景群体数量根据每种细胞类型和每种比较中DEG分析中所有受测基因进行调整（我们在任一组中使用最小表达百分比0.01来获取背景基因）。每条通路的log2FC总和由该通路所有成员基因的log2FC值求和计算得出。我们分别对上调基因、下调基因以及上调与下调基因合并后进行通路富集分析。我们发现大多数通路为上调或下调（通过通路成员基因的log2FC总和判断），并决定可视化这些结果，因为它们更具生物学可解释性，且在大多数情况下产生了更显著的富集结果。

基因调控网络推断与网络模块识别
我们使用单细胞整合基因调控网络（SCING）方法，该方法基于利用梯度提升进行有向调控边推断，并利用互信息进行边剪枝，从我们的海马（Hip）和下丘脑（Hyp）小胶质细胞scRNA-seq数据中构建基因调控网络模型。网络推断的参数设置为：超细胞数为500，100个中间网络，基于高基因表达方差的4000个输入基因，每个基因考虑100个最近邻作为潜在相互作用邻居，每个中间网络构建时采用70%的子采样比例，合并共识比例为20%。从生成的基因调控网络（海马：16,737条边和4,686个节点；下丘脑：14,924条边和4,807个节点）中，我们提取了仅包含至少一种比较中为DEG的枢纽基因及其直接邻居的网络子集（海马：3,376条边和690个节点；下丘脑：2,191条边和534个节点）。对这些子网络运行Leiden社区检测算法，分辨率为0.0055，每个海马和下丘脑各生成10个模块，每个模块至少包含8个基因。这些模块的通路富集分析如前一节所述进行。对于网络可视化，这些反应性子网络进一步缩减为仅包含DEG节点（海马：2,416条边和437个节点；下丘脑：1,501条边和327个节点）。

DEG与AD GWAS信号的富集分析
使用Mergeomics R包中的标记集富集分析（MSEA）来检验DEG（平均log2FC > 0.25且校正p值 < 0.05）对人类AD GWAS信号的富集。使用biomaRt将DEG小鼠基因符号转换为人类基因符号。对于每项GWAS研究，SNP基于连锁不平衡r2 < 0.5进行过滤（来自1000 Genomes Project，欧洲血统，人群编码为'CEU'），SNP基于50 kb距离映射到基因，并采用按p值显著性排序的前20% GWAS信号进行分析。MSEA使用一种类似卡方统计量的方法来总结基因（DEG）集在多个SNP关联分位数上的富集情况。富集p值使用Benjamini-Hochberg方法进行校正以估计错误发现率。

细胞谱系轨迹分析
使用Slingshot在UMAP空间中构建小胶质细胞和星形胶质细胞的拟时序轨迹，该方法通过创建基于聚类的最小生成树来建模全局谱系结构，然后使用同时主曲线拟合预测谱系中的平滑分支曲线。我们采用半监督方法，仅将起始聚类（即WT细胞比例最高的聚类）指定为引导预测。使用tradeSeq对拟时序轨迹进行单独分析，通过对前2000个高变基因（HVG）拟合负二项广义可加模型并执行Wald检验，以识别与每条轨迹显著相关的、具有线性或非线性表达模式的HVG。

细胞-细胞通讯分析
使用NicheNet（v 2.2.0）的predict_ligand_activities()函数，基于相应的DEG（校正p值 < 0.05且平均log2FC绝对值 > 0.25）预测每种组织、每种条件下每种细胞类型的配体活性。接收细胞的背景表达基因为由超过10%的细胞表达的基因。配体的排名基于其靶基因在DEG中相对于背景的富集程度。对于配体-受体聚焦分析，使用配体-受体分析框架（LIANA）（v 0.1.14）的liana_wrap()函数，采用默认设置，输出来自多种细胞-细胞通讯方法的排名、p值和得分，包括Connectome、NATMI、SingleCellSignalR和CellPhoneDB。使用liana_aggregate()函数计算不同方法之间的共识排名。

定量与统计分析
对于Barnes水迷宫实验和IPGTT数据，各时间点组间的配对比较使用Wilcoxon秩和检验。对于Aβ斑块数量和面积，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Fisher最小显著差异（LSD）事后检验来推导组间p值。体重、体重增加百分比、食物摄入、饮水摄入和总热量摄入使用多因素方差分析进行分析，详见相应图注。p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。所有统计细节，包括统计检验方法、样本量、集中趋势、离散度和精度指标的定义以及星号标注，均可在图注中找到。实验变量以均值±标准误（SEM）表示，除非另有说明。统计分析使用R编程语言（版本4.2.1）和GraphPad Prism（版本7和11）完成。

补充信息（27）
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文件S1. 图S1–S18

电子表格（1.62 MB）
表S1. 海马（Hip）和下丘脑（Hyp）各细胞类型的标记基因前排名，与图2A相关

电子表格（30.69 KB）
表S2. 每种细胞类型和组织的样本数，与图2D和S3相关

电子表格（158.70 KB）
表S3. scCODA差异细胞类型组成检验结果，与图2D和S3相关

电子表格（33.00 KB）
表S4. 各比较中不同组别细胞间转录组整体变化的欧氏距离分析，与图2B和2C相关

电子表格（2.79 MB）
表S5. 每种细胞类型和组织中各比较的差异表达基因（DEG），与图3和S4相关

电子表格（6.79 MB）
表S6. 每种细胞类型和组织中各比较的拟聚合DEG（使用DESeq2），与图3相关

电子表格（978.82 KB）
表S7. 各细胞类型、组织和比较中DEG的通路富集分析，与图S4相关

电子表格（784.61 KB）
表S8. 海马和下丘脑星形胶质细胞亚簇标记基因，与图S9相关

电子表格（1.00 MB）
表S9. 星形胶质细胞亚簇特异性及组织特异性标记基因，与图S9相关

电子表格（10.98 KB）
表S10. 每个样本和组织的星形胶质细胞亚簇计数，与图S9相关

电子表格（82.39 KB）
表S11. 各组织星形胶质细胞亚簇scCODA差异组成检验结果，与图S9相关

电子表格（536.45 KB）
表S12. 海马小胶质细胞单细胞整合基因调控（SCING）网络，与图S14和S15相关

电子表格（482.83 KB）
表S13. 下丘脑小胶质细胞SCING网络，与图S14和S15相关

电子表格（51.63 KB）
表S14. 使用海马小胶质细胞网络和海马小胶质细胞各比较DEG的关键驱动因子分析（KDA）结果，与图S14和S15相关

电子表格（46.00 KB）
表S15. 使用下丘脑小胶质细胞网络和下丘脑小胶质细胞各比较DEG的KDA结果，与图S14和S15相关

电子表格（34.67 KB）
表S16. 海马和下丘脑小胶质细胞SCING网络模块/社区（使用Leiden社区检测），与图S14和S15相关

电子表格（17.01 KB）
表S17. 海马和下丘脑小胶质细胞SCING网络模块之间的富集分析，与图S14和S15相关

电子表格（302.25 KB）
表S18. 海马和下丘脑小胶质细胞SCING网络模块的通路富集分析，与图S14和S15相关

电子表格（20.60 KB）
表S19. 海马和下丘脑小胶质细胞SCING网络模块的DEG富集分析，与图S14和S15相关

电子表格（199.03 KB）
表S20. 海马和下丘脑小胶质细胞亚簇标记基因

电子表格（724.64 KB）
表S21. 海马和下丘脑小胶质细胞亚簇标记基因（拟聚合差异分析方法）

电子表格（10.39 KB）
表S22. 每个样本和组织的小胶质细胞亚簇计数

电子表格（56.17 KB）
表S23. 各组织小胶质细胞亚簇scCODA差异组成检验结果

电子表格（52.23 KB）
表S24. NicheNet配体排名，与图6和S17相关

电子表格（7.38 MB）
表S25. LIANA细胞-细胞通讯分析，与图6相关

电子表格（224.91 KB）
表S26. 标记集富集分析（MSEA）结果显示各细胞类型、组织和比较中DEG的AD GWAS富集情况，与图S18相关