ADH5-K113乳酰化与腺性膀胱炎糖酵解增强及膀胱上皮细胞增殖的相关性研究

《Journal of Inflammation Research》：ADH5 K113 Lactylation is Associated with Enhanced Glycolysis and Bladder Epithelial Cell Proliferation in Cystitis Glandularis

　　

背景：腺性膀胱炎（cystitis glandularis, CG）是膀胱尿路上皮常见的炎性增殖性疾病，组织学以Brunn’s nest形成和腺样化生（adenoid metaplasia）为标志。目前CG发生的分子机制尚不明确，调控膀胱上皮细胞异常增殖的关键信号通路仍待探索。乳酸（lactate）是厌氧糖酵解的副产物，也是乳酰化（lactylation）的底物；乳酰化是近年发现的翻译后修饰，已被证明在炎症反应和细胞增殖中发挥调节作用。然而，该修饰是否发生于CG膀胱上皮细胞及其潜在作用仍未知。方法：采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的大鼠CG模型和LPS处理的SV-HUC-1人膀胱上皮细胞系。乳酸检测试剂盒评估细胞、动物组织和人血清中乳酸含量；Seahorse分析仪检测糖酵解ATP产量、氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）和细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）。定量乳酰化组学（quantitative lactylation omics）筛选CG大鼠膀胱上皮细胞中差异乳酰化蛋白及位点。Western blot检测泛赖氨酸乳酰化（pan-lysine lactylation, Pan Kla）和ADH5-K113乳酰化水平。qPCR和Western blot检测PKM2和LDHA的mRNA及蛋白表达。免疫荧光检测大鼠膀胱PKM2、LDHA表达。CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性，划痕试验评估细胞迁移功能。HE染色观察大鼠膀胱Brunn’s nest形成。结果：CG大鼠和LPS处理的SV-HUC-1细胞中乳酸水平显著升高，糖酵解ATP生成率和ECAR增加，糖酵解增强。体内外实验证实PKM2和LDHA的mRNA及蛋白水平上调。组学分析进一步揭示糖酵解通路存在广泛差异乳酰化，其中酒精脱氢酶5赖氨酸113乳酰化（alcohol dehydrogenase 5 lysine 113 lactylation, ADH5-K113la）上调最显著（log₂FC = 2.463，FC = 5.52，P = 0.000101）。CG中Pan Kla和ADH5-K113乳酰化水平显著升高。CCK-8和划痕实验证实LPS处理促进SV-HUC-1细胞增殖和迁移。HE染色显示CG大鼠膀胱Brunn’s nest数量增加。结论：CG中乳酸积累和糖酵解增强，ADH5-K113乳酰化水平显著上调，与PKM2、LDHA表达升高及细胞增殖相关，提示ADH5-K113乳酰化与CG糖酵解增强和增殖相关，并可能参与CG发病机制。

研究背景：腺性膀胱炎（cystitis glandularis, CG）是膀胱尿路上皮慢性炎性增殖性病变，组织学以Brunn’s nest形成和腺样化生（adenoid metaplasia）为特征。近年膀胱镜广泛应用使CG检出率增加，临床症状多为下尿路反复刺激或血尿。学术界对CG治疗意见不统一：部分观点将其视为癌前病变并推荐手术，专家共识则指出CG不一定恶变，过度治疗会损害患者身心。该分歧源于CG分子病理机制认识不足，驱动Brunn’s nest和上皮增生的分子通路尚未阐明。既往文献提示糖酵解（glycolysis）促进和乳酸（lactate）积累在多种炎性增生中具有重要意义，因此研究人员进一步分析异常糖酵解和乳酸积累是否参与CG发病。乳酸长期被视为糖酵解终产物，近年研究确认乳酰化（lactylation）可共价结合蛋白赖氨酸残基，直接调控组蛋白和非组蛋白功能，广泛参与炎症反应和细胞增殖；非组蛋白乳酰化还可调控代谢酶催化活性。但膀胱上皮细胞尤其CG中乳酰化情况未见报道。酒精脱氢酶5（alcohol dehydrogenase 5, ADH5）最早已知为甲醛和S-亚硝基谷胱甘肽代谢酶，维持细胞内氧化还原平衡，后续发现其参与非小细胞肺癌等肿瘤细胞增殖和上皮-间质转化调控，但其乳酰化功能不明。研究人员此前用定量乳酰化组学筛选CG模型大鼠膀胱上皮细胞，发现糖酵解通路多个代谢酶存在差异乳酰化，其中ADH5赖氨酸113乳酰化（ADH5-K113la）上调最显著；生物信息学和初步实验提示ADH5-K113乳酰化可能与PKM2和LDHA表达升高相关。因此本研究旨在明确CG中ADH5-K113乳酰化变化，并探讨其与PKM2、LDHA及细胞增殖的关系。研究首次在CG膀胱上皮细胞观察乳酰化变化，填补膀胱疾病乳酰化研究空白；核心发现ADH5-K113乳酰化显著上调，与PKM2、LDHA表达升高及糖酵解增强、细胞增殖和Brunn’s nest形成相关，提示其可能参与CG发病机制，并为理解CG代谢异常与上皮增殖关系提供实验依据。

关键技术方法：采用LPS诱导的大鼠CG模型和LPS处理的SV-HUC-1人膀胱上皮细胞系；大鼠为雌性SD大鼠，购自贵州Biouhan Biotechnology Co., Ltd.，临床血清样本来自CG患者与健康对照各6例（经桂林医学院第二附属医院伦理批准并获书面知情同意），SV-HUC-1购自Procell。关键技术包括乳酸检测、Seahorse XFe96分析糖酵解ATP产量/OCR/ECAR、定量乳酰化组学、Western blot、qPCR、免疫荧光、CCK-8、划痕试验和HE染色。

研究结果：
CG中乳酸积累伴糖酵解增强：研究人员从细胞、动物组织和临床血清三个层面检测乳酸，LPS处理SV-HUC-1细胞上清乳酸显著高于对照，CG大鼠膀胱组织匀浆乳酸显著高于正常对照，CG患者血清乳酸显著高于健康对照。Seahorse检测显示LPS处理后糖酵解通路和线粒体通路ATP生成率均高于对照，糖酵解来源ATP增加更显著；OCR及基础呼吸、最大呼吸升高；ECAR及糖酵解、糖酵解能力升高。结论为CG存在明显乳酸积累和糖酵解增强，并伴氧化磷酸化功能激活，二者可能为乳酰化发生提供有利条件。

CG中PKM2和LDHA表达上调：在LPS处理SV-HUC-1细胞中，qPCR显示PKM2、LDHA mRNA显著高于对照，Western blot显示蛋白显著上调；大鼠CG模型膀胱上皮中mRNA和蛋白同样升高；免疫荧光显示CG组膀胱上皮PKM2、LDHA荧光强度显著高于对照，并见尿路上皮增厚、细胞排列紊乱和分层不均。结论为PKM2和LDHA在CG中mRNA和蛋白水平上调，与糖酵解活性增强表型一致。

乳酰化组学分析鉴定ADH5-K113乳酰化：对对照组和CG组大鼠膀胱上皮组织行定量乳酰化组学，火山图显示大量差异乳酰化蛋白，ADH5 K113在CG组特别上调；定量分析ADH5 K113乳酰化水平显著高于对照（log₂FC = 2.463，FC = 5.52，P = 0.000101）。糖酵解通路相关蛋白多个位点乳酰化，包括LDHA-K126、ALDOA-K13/K14/K42/K230、TPI1-K14、PFKL-K677、PGM1-K349、ACSS1-K615和ADH5-K113，其中ADH5 K113上调最显著；质谱确认含K113乳酰化修饰肽TNLCQKIR。KEGG富集显示差异蛋白显著富集于多个代谢通路，糖酵解/糖异生通路居前五；GO生物过程富集主要涉及ATP合成偶联质子转运和三羧酸循环等能量代谢过程；Motif分析给出乳酰化位点邻近氨基酸序列特征。结论为CG糖酵解通路蛋白发生广泛乳酰化，ADH5 K113是最显著位点之一，提示其可能参与CG代谢调控。

CG中整体乳酰化与ADH5-K113乳酰化水平升高：细胞实验中LPS处理SV-HUC-1后Pan Kla信号显著增强，ADH5总蛋白升高且K113位点乳酰化上调；大鼠CG模型膀胱上皮Pan Kla高于对照，ADH5总蛋白升高，ADH5-K113乳酰化显著上调。结论为细胞和动物水平均验证CG整体乳酰化及ADH5-K113乳酰化升高，与组学分析一致。

CG膀胱上皮细胞增殖和迁移能力增强：划痕试验显示LPS组24 h和48 h愈合率显著高于对照；CCK-8显示LPS组24 h和48 h OD值显著高于对照；HE染色显示CG大鼠膀胱黏膜上皮层显著增厚，黏膜下出现典型Brunn’s nest，对照组未见Brunn’s nest，CG组Brunn’s nest数量显著增加。结论为CG膀胱上皮细胞增殖和迁移增强，伴Brunn’s nest形成。

机制模型：基于上述结果，研究人员提出ADH5-K113乳酰化参与CG发病的工作模型：LPS刺激引起膀胱上皮细胞乳酸积累，进而激活糖酵解通路，上调PKM2和LDHA表达，ADH5表达也增加；乳酰化组学锁定ADH5-K113乳酰化为CG最上调差异位点；后续验证显示CG整体乳酰化及ADH5-K113乳酰化显著升高，这些结果与膀胱上皮细胞增殖增强、迁移加速和Brunn’s nest形成密切相关。该模型为理解ADH5-K113乳酰化调控CG代谢提供初步框架，但其底层分子机制仍待阐明。

讨论部分总结：讨论指出，CG中乳酸积累和糖酵解增强在体内外均得到证实，表现为乳酸水平升高、糖酵解ATP生成率加快和ECAR上调，PKM2、LDHA高表达提示糖酵解通路异常激活参与CG病理过程；乳酸不仅是代谢副产物，也可作为信号分子通过调控基因表达和蛋白修饰影响细胞行为。乳酰化自2019年首次报道以来被认为是连接代谢与基因调控的重要翻译后修饰，在肿瘤、炎症、巨噬细胞极化、脓毒症、化疗耐药和代谢网络重塑中发挥作用，但膀胱上皮细胞和CG中未见报道；本研究首次观察CG膀胱上皮细胞乳酰化变化，填补膀胱疾病乳酰化研究空白。核心发现是ADH5-K113乳酰化显著上调；ADH5传统认识为甲醛和S-亚硝基谷胱甘肽代谢酶，维持氧化还原平衡，越来越多证据显示其还参与肿瘤细胞增殖和代谢调控；本研究首次证实ADH5是乳酰化底物，K113位点乳酰化在CG显著升高，并与PKM2、LDHA表达上调和糖酵解增强相关，将ADH5功能研究从传统氧化还原调控扩展到乳酰化介导的代谢调控。PKM2负责磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸转化，LDHA介导丙酮酸向乳酸转化，二者在CG中上调与乳酸积累和糖酵解增强表型一致，也与其他增殖性疾病中糖酵解酶高表达模式一致；组学提示糖酵解通路多个酶存在差异乳酰化，研究人员推测CG中可能存在乳酰化介导的代谢调控网络，ADH5-K113la作为最显著变化位点可能是关键节点，但ADH5-K113乳酰化是否直接调控PKM2和LDHA转录仍需染色质免疫沉淀-qPCR（chromatin immunoprecipitation-qPCR, ChIP-qPCR）和位点突变等实验验证；当前数据建立ADH5-K113乳酰化与CG增殖表型强相关，因果作用需ADH5敲低或K113突变等功能验证，未来将用CRISPR-Cas9（成簇规律间隔短回文重复及相关蛋白9）介导的ADH5敲除或K113R敲入模型。临床转化方面，CG治疗不统一源于缺乏判断疾病进展风险的分子指标；ADH5-K113la与细胞增殖增强和Brunn’s nest形成相关，提示乳酰化相关分子有潜力作为评估CG病变活动性的候选标志物；针对乳酸产生或乳酰化的干预策略在多种疾病模型显示疗效，为CG药物治疗提供新方向；靶向乳酰化相关通路尤其ADH5-K113乳酰化可能为乳酸水平升高的CG患者提供非手术治疗选择，但需进一步评估安全性和有效性。局限性包括：乳酰化组学使用大鼠CG模型，虽规避临床样本取样困难，但大鼠与人膀胱上皮乳酰化谱存在物种差异，未来需在人组织样本验证关键位点；未进行ADH5敲低或K113位点特异性突变实验，无法建立ADH5-K113乳酰化与PKM2/LDHA上调的因果关系；细胞实验仅使用SV-HUC-1单细胞系，限制结论完整性。

研究结论翻译：总之，本研究发现CG中乳酸积累和糖酵解增强，PKM2和LDHA在mRNA和蛋白水平均上调；通过乳酰化组学分析，研究人员首次鉴定ADH5-K113乳酰化是CG膀胱上皮细胞中最显著上调的差异乳酰化位点，该修饰升高伴随整体乳酸水平增加、细胞增殖和迁移增强以及Brunn’s nest形成。上述结果揭示乳酰化在CG中的潜在意义，ADH5-K113乳酰化可能成为理解CG发病机制和优化临床管理的新线索。