《Fermentation》：Probiotic Potential and Acidification Capacity of Pediococcus acidilactici PA-X1 Isolated from Fermented Yak Yogurt: Phenotypic and Genomic Characterization
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兼具益生特性、酸化能力与胁迫耐受性的乳酸菌（LAB）对食品发酵具有重要价值，但其表征仍不充分。本研究从青海–藏高原采集的牧区发酵牦牛酸奶中分离到一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），命名为PA-X1。研究人员考察了其体外益生相关特
兼具益生特性、酸化能力与胁迫耐受性的乳酸菌（LAB）对食品发酵具有重要价值，但其表征仍不充分。本研究从青海–藏高原采集的牧区发酵牦牛酸奶中分离到一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），命名为PA-X1。研究人员考察了其体外益生相关特性、酸化性能、基因组特征及酸化相关代谢关键基因的表达模式。发酵24 h后，发酵液pH降至3.75 ± 0.02，L-乳酸浓度达8.53 ± 0.23 g/L。葡萄糖浓度由0 h实测初始值20.0 g/L降至24 h的6.00 g/L，对应70.0%的葡萄糖消耗率。PA-X1在pH 3.0下的存活率为94.64 ± 0.10%，其培养上清在体外抑制全部三种测试指示菌，即Escherichia coli、Salmonella enterica和Staphylococcus aureus。基因组分析鉴定出多个与酸化相关代谢有关的基因，包括参与磷酸转移酶系统（PTS）、恩布登–迈耶霍夫–帕纳斯途径（EMP）、丙酮酸代谢和乳酸合成的基因。此外，PTS相关基因ptsI、ptsH和crr在高葡萄糖条件（40 g/L）下显著上调，而低pH条件诱导糖酵解和丙酮酸代谢相关基因pgk、eno、tpiA、ldhA、ldhL和ackA不同程度上调。综合表型、基因组和基因表达结果，PA-X1的酸化表型可能与碳水化合物摄取、糖酵解、丙酮酸代谢及有机酸形成有关。总体而言，PA-X1兼具益生相关、酸化和抗菌特性，支持其作为功能性发酵剂用于开发具有更高微生物安全性和功能价值的益生发酵食品的潜力。
论文主体解读：乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品发酵体系中的关键功能微生物，其酸化能力关系到发酵性能、 undesirable微生物抑制和产品稳定性；食品用LAB还需具备胁迫耐受、安全性和抗菌活性。传统发酵食品是LAB的重要资源库，但已报道菌株多来自常规发酵食品、乳制品和动物胃肠道。高原传统发酵牦牛酸奶具有特定原料、加工方式和区域微生物生态，且低氧、强紫外和温差变化可能影响微生物库，因而可能提供不同于常规乳制品的LAB资源；但来源生态特殊性不必然代表优良发酵性能，仍需在菌株水平系统评价其耐酸、酸化性能与安全性。LAB酸化表型受碳水化合物转运、糖酵解、丙酮酸代谢和酸应激反应协同调控；全基因组分析可揭示代谢基因库，但基因存在不等于特定发酵条件下表达或功能贡献，因此需整合发酵表型、基因组特征和胁迫响应基因表达。高原牦牛酸奶来源LAB中这些证据层次间关系尚不充分。为此，研究人员从传统发酵牦牛酸奶获得三株LAB，初步评价耐酸、胆盐、安全性、抗菌和酸化性能，并选PA-X1进一步全基因组测序和定量逆转录PCR（qRT-PCR），整合表型、基因组和转录证据，表征其酸化表型相关基因组特征，评估其作为食品发酵功能候选发酵剂的潜力。
关键技术方法：以青海农牧区低pH自制发酵牦牛酸奶为样本，分离PA-X1、K1JD和LF-12，PA-X1重点研究，K1JD/LF-12作初步比较；测定耐酸（pH 2.0–5.0）、胆盐（0.1%–0.3%）、自聚集、疏水性、牛津杯抑菌、纸片扩散抗生素敏感性和溶血；监测生长、pH、L-乳酸、葡萄糖及EDTA-钙滴定总酸；采用PacBio+Illumina全基因组测序、组装、ANIb（基于BLAST的平均核苷酸一致性）及多数据库注释；以16S rRNA为内参，qRT-PCR分析MRS（de Man, Rogosa, and Sharpe）培养基（20 g/L葡萄糖、pH 6.5）、高糖（40 g/L）及pH 3.0/4.0/5.0下关键基因表达。
3.1 形态特征与鉴定：通过菌落形态、革兰染色、扫描电镜、16S rRNA基因测序及ANIb分析，三株分离株中PA-X1为革兰阳性、球形或近球形、成对/四联/簇状排列，系统发育和基因组AN Ib支持其鉴定为Pediococcus acidilactici；PA-X1与六株参考基因组ANIb为97.19%–98.42%，与P. pentosaceus ATCC 25745为75.95%。
3.2 三株LAB分离株的胃肠道耐受性与黏附相关特性：通过酸和胆盐耐受、自聚集及细胞表面疏水性实验，PA-X1在pH 2.0–5.0下存活率随pH升高而增加，pH 3.0时达94.64 ± 0.10%，高于K1JD和LF-12；0.3%胆盐下存活率为73.36 ± 1.60%，亦高于两株比较菌；自聚集率为82.13 ± 0.73%，疏水性为65.90 ± 1.22%，高于K1JD和LF-12。结果表明在所测体外条件下PA-X1具有较有利的耐酸、耐胆盐和黏附相关特性。
3.3 三株LAB分离株的体外抑制活性：通过牛津杯法检测培养上清对Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Salmonella enterica的抑制圈，PA-X1对三者均产生抑制圈，分别为21.06 ± 0.10 mm、19.27 ± 0.25 mm和18.15 ± 0.24 mm，且对三种指示菌的抑制圈均显著大于K1JD；对E. coli和S. enterica的抑制圈大于LF-12，对S. aureus亦大于LF-12。结果表明PA-X1培养上清对三种测试病原菌具有体外抑制活性，但因上清未中和且pH约3.75，不能区分低pH/有机酸与其他胞外抗菌代谢物的贡献。
3.4 三株LAB分离株的初步体外安全性相关评估：通过纸片扩散法检测8种抗生素敏感性并以血平板观察溶血，PA-X1对青霉素、四环素、万古霉素和红霉素出现可测抑制圈，对多粘菌素B、卡那霉素和链霉素抑制圈较小或不可测，对庆大霉素呈类似反应；PA-X1、K1JD和LF-12均无溶血圈，分类为γ-溶血。结果提供初步表型安全性资料，但抗生素耐药基础仍需进一步确定。
3.5 PA-X1的生长特性与酸化性能：通过24 h静态发酵监测OD600、pH、L-乳酸、葡萄糖及EDTA-钙滴定总酸，PA-X1前2 h滞后期短，2–10 h快速生长，随后增势放缓；24 h时pH降至3.75 ± 0.02，L-乳酸为8.53 ± 0.23 g/L，48 h升至9.13 ± 0.12 g/L；葡萄糖由20.0 g/L降至24 h的6.00 g/L和48 h的3.60 g/L，对应消耗率70.0%和82.0%；24 h总酸（以乳酸当量表示）为36.33 ± 0.79 g/L。结果表明PA-X1在所测条件下具有较强酸化、产L-乳酸和葡萄糖利用能力。
3.6 乳酸片球菌PA-X1的基因组特征与酸化相关代谢基因：通过PacBio+Illumina全基因组测序、组装及多数据库注释，PA-X1完整基因组为单一环状染色体，大小2,192,629 bp，G+C含量42.14%，含2129个蛋白编码基因、60个tRNA基因、15个rRNA基因和1个sRNA基因，并预测26个分泌蛋白基因、4个前噬菌体区域和2个CRISPR阵列；NR注释基因最多（2122），COG 1627、KEGG 1190、CAZy 640；CARD（综合抗生素耐药数据库）未检测到推定获得性耐药基因。COG中碳水化合物转运与代谢基因最多（218个），KEGG中全局概览图（374个）和碳水化合物代谢（174个）较多，膜转运通路105个，GO主要富集于代谢过程、催化活性和转运体活性。结果提示PA-X1具有较强碳源摄取和初级代谢的基因组基础，并支持其酸化相关代谢潜力。
3.7 酸化相关通路与基因分析：通过基因组注释和代谢通路分析，PA-X1携带PTS相关基因ptsH、ptsI、crr、manXYZ、scrA和celB，糖酵解相关基因pgk、tpiA、fba和eno，乳酸形成相关基因ldhL和ldhA，以及丙酮酸脱氢酶复合体基因pdhABCD和乙酸激酶基因ackA。结果表明PA-X1具有较完整的碳水化合物摄取、糖酵解、丙酮酸代谢、乳酸形成及乙酸合成分支的基因基础。
3.8 不同胁迫条件下PA-X1关键酸化基因的表达：通过qRT-PCR比较标准MRS、高糖（40 g/L）及pH 3.0/4.0/5.0条件，高糖下PTS相关基因ptsI、ptsH和crr显著上调（p < 0.001），其中ptsH增幅最大；酸性条件下糖酵解相关基因pgk、eno和tpiA均上调，一般在pH 4.0较高、pH 3.0较低；ldhA和ldhL在pH 5.0和4.0显著上调并在pH 3.0仍较高，ldhL在pH 4.0表达较高；ackA在酸性条件下显著上调，pH 5.0和4.0强于pH 3.0。结果提示PA-X1的PTS、糖酵解、丙酮酸代谢和乳酸/乙酸形成相关基因对高糖或酸性条件具有表达响应。
讨论部分总结：讨论指出LAB酸化对发酵食品快速降pH、风味形成、品质稳定及抑制腐败菌和食源性病原菌重要，筛选强酸化、环境适应性和抗菌的食品源LAB对功能发酵剂、天然生物防腐剂和功能发酵食品开发重要。PA-X1在24 h静态发酵中pH降至3.75、L-乳酸8.53 g/L、消耗70.0%葡萄糖；既往研究因菌株背景、培养基、发酵模式、pH控制、通气/搅拌、发酵时间和分析方法差异大，不能直接排名，且部分文献乳酸未区分立体异构体，故PA-X1价值在于酸化、益生相关特性、胁迫耐受和抑菌活性的组合，而非最高L-乳酸产量。基因组注释提示PTS介导碳源摄取，EMP产生丙酮酸、ATP和NADH，丙酮酸向乳酸和乙酸分支分配，可能共同贡献酸化表型和部分抑菌表型；乳酸形成可再生NAD
+以维持糖酵解，乙酸分支可额外生成ATP。抑菌上清未中和且pH约3.75，低pH和有机酸可能至少部分贡献抑菌，但不能排除其他胞外抗菌代谢物，需用中和上清及蛋白酶、过氧化氢酶处理区分。PA-X1对庆大霉素、卡那霉素和链霉素的表型耐药在乳酸菌包括Pediococcus中常见，可能为固有特性，但纸片扩散不能确定，CARD未发现高置信度获得性耐药基因，仍需MIC和遗传学表征。qRT-PCR显示高糖下ptsI、ptsH、crr显著上调，酸性下pgk、eno、tpiA、ldhA、ldhL、ackA变化，ldhA和ldhL在酸性条件下持续上调，提示酸化表型可能涉及糖摄取、糖酵解、丙酮酸代谢和乳酸形成的表达变化；但16S rRNA为单一内参且在pH 3.0和高糖下Ct值有变化，稳定性未完全确认，不同pH生长速率导致取样时间和生理状态差异也可能影响表达结果。整体表型、基因组和qRT-PCR支持PA-X1酸化潜力，但研究主要基于体外、基因组和选定基因qRT-PCR，需在发酵乳或酸奶等实际食品基质中验证酸化动力学、发酵性能、感官、储藏稳定性和实际安全。
研究结论翻译：本研究从青海–藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离Pediococcus acidilactici PA-X1，并评价其酸化和益生相关特性。24 h静态发酵后，发酵液pH降至3.75 ± 0.02，L-乳酸浓度达8.53 ± 0.23 g/L，消耗70.0%初始葡萄糖。PA-X1在pH 3.0下存活率为94.64 ± 0.10%，并对全部三种测试指示菌表现体外抑制活性。基因组注释和qRT-PCR结果提示，其酸化表型可能与碳水化合物摄取、糖酵解、丙酮酸代谢和有机酸形成有关。总体而言，这些发现支持进一步评估PA-X1作为食品源候选发酵剂用于功能性发酵食品。仍需在实际食品基质中验证以确定其发酵性能、感官效应、储藏稳定性和实际安全性。
