《BioTech》：Cell-Based Assay Development and Standardization for Antibody–Drug Conjugates
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ADC-111是一种靶向Antigen-1的抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC），约八个有效载荷（payload）通过共价连接于单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）上。ADC-111的主要作用机制（me
ADC-111是一种靶向Antigen-1的抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC），约八个有效载荷（payload）通过共价连接于单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）上。ADC-111的主要作用机制（mechanism of action，MoA）为抗原-抗体结合介导内化后由有效载荷诱导的细胞毒性。研究人员开发了一种基于T24工程细胞（过表达Antigen-1）的细胞学效力测定方法（cell-based assay，CBA），并进行了与开发阶段相适应的验证，用于测定ADC-111药物原液（drug substance，DS）和药物成品（drug product，DP）的效力。该测定方法具有特异性和稳定性指示特性，能够检测由抗体互补决定区（complementarity-determining region，CDR）降解引起的效力损失，并与Antigen-1结合酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）结果高度相关，证明ADC-111 CBA具有抗原结合依赖性。CBA测得的效力与不同药物-抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）值之间也表现出良好相关性，而ELISA则未呈现该相关性。值得注意的是，即用型（ready-to-use，RTU）CBA格式与连续培养（continuous culture，CC）格式在相同操作流程下表现出相当的性能，两种格式可互换使用。此外，研究人员利用同一亲本细胞系T24工程化表达其他肿瘤抗原，相应的CBA同样表现出良好的特异性，验证了使用单一亲本细胞系开发多种ADC的CBA以实现标准化并加速方法开发的可行性。
一、研究背景与意义
抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）是由单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）通过化学连接子（linker）共价偶联细胞毒性有效载荷（payload）构成的一类精准药物。ADC的抗体部分识别肿瘤细胞表面的靶抗原，通过内吞作用进入细胞，随后有效载荷释放至细胞质中诱导肿瘤细胞凋亡。除这一经典作用机制（mechanism of action，MoA）外，ADC还可能涉及旁观者效应、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）及补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）等机制。尽管ADC在肿瘤治疗中展现出显著疗效，但由于分子结构的复杂性，其在化学、制造和控制（chemistry， manufacturing， and controls，CMC）方面面临重大挑战。效力（potency）作为ADC药物原液（drug substance，DS）和药物成品（drug product，DP）放行及稳定性规格中的关键质量属性（critical quality attribute，CQA），通常通过细胞学效力测定（cell-based assay，CBA）进行评价。与酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）等抗原结合测定不同，CBA能够反映ADC与靶细胞结合后的生物学后果，因此被监管机构视为ADC临床开发的关键分析控制手段。然而，开发一种能够反映ADC作用机制、特异性强且稳健可靠、并能灵敏检测ADC结构和功能细微变化的CBA仍面临巨大挑战，且需要较长的开发周期。本研究以ADC-111为模型药物，系统开展了CBA的开发、验证及标准化探索。
二、研究内容与结论
ADC-111是一种靶向Antigen-1的ADC，约八个拓扑异构酶I抑制剂通过可裂解连接子经链间二硫键偶联至单克隆抗体。研究人员利用慢病毒转导技术构建了稳定表达Antigen-1的T24-Antigen-1+细胞系，建立了包含主细胞库（master cell bank，MCB）和工作细胞库（working cell bank，WCB）的两级细胞库系统。在此基础上开发了ADC-111 CBA，并按照ICH Q2（R2）和USP <1033>指南进行了与开发阶段相适应的验证。验证结果表明，该方法的特异性、线性、相对准确度、精密度和范围均满足要求。研究进一步证明，ADC-111 CBA具有稳定性指示特性，能够检测由氧化应激导致的抗体互补决定区（complementarity-determining region，CDR）降解引起的效力损失，且与ELISA结果高度一致。更重要的是，CBA能够灵敏反映药物-抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）的变化，而ELISA则无法检测此类差异。此外，即用型（ready-to-use，RTU）细胞格式与连续培养（continuous culture，CC）格式在相同操作流程下表现出相当的性能，两种格式可互换使用。最后，研究人员利用同一亲本细胞系T24工程化表达其他肿瘤抗原，成功开发了针对其他ADC的CBA，验证了单一亲本细胞系用于多种ADC的CBA开发的可行性。这一标准化方法可显著加速ADC的CBA开发进程。
三、主要关键技术方法
本研究涉及的关键技术方法主要包括：利用慢病毒转导和有限稀释法构建稳定表达目标抗原的T24工程细胞系并建立两级细胞库系统；基于细胞活力检测（CellTiter-Glo试剂）的细胞学效力测定方法，通过平行线分析计算相对效力（relative potency，%RP）；采用强制降解（AAPH氧化、热应激、光应激）制备降解样品以评估方法的稳定性指示能力；通过调整还原剂和连接子-有效载荷比例制备不同DAR的ADC样品；采用反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）测定DAR；以及基于重组人Antigen-1蛋白包被的ELISA用于测定抗原结合活性。样本来源方面，ADC-111参考标准（reference standard，RS）及强制降解样品由四川科伦博泰生物医药股份有限公司生产。
四、研究结果
4.1 ADC-111 CBA特异性
为评估ADC-111 CBA的特异性，研究人员将同型ADC（isotype ADC）、ADC-111 mAb、游离有效载荷和未偶联的连接子-有效载荷与ADC-111在CBA中进行比较。结果表明，ADC-111的mAb部分不产生细胞毒性，游离有效载荷的细胞毒性略低于ADC-111，未偶联的连接子-有效载荷的细胞毒性更弱，而具有相同连接子-有效载荷和DAR但不靶向人源抗原的同型ADC仅产生极低的细胞毒性，证明ADC-111的细胞毒性具有抗原结合依赖性。进一步实验显示，ADC-111在Antigen-1阴性的亲本T24细胞中仅产生极低的细胞毒性，确认了该CBA对Antigen-1的特异性。
4.2 CBA稳定性指示特性及与ELISA的相关性
研究人员对ADC-111强制降解样品同时进行CBA和ELISA检测。结果显示，热应激未引起效力损失，而AAPH和0.5x光应激在ELISA和CBA中均引起显著效力损失，与抗体CDR区域HC-W37和LC-W94氧化水平升高一致。1.0x及以上光应激导致严重降解，DAR、ELISA和CBA均无法获得有效数据。在AAPH应激条件下，DAR仅从7.8轻微下降至6.7，不是CBA效力损失的主要贡献因素。CBA与ELISA测定的效力结果高度一致（R2=0.96，斜率=0.99），证实CBA具有抗原结合依赖性。
4.3 CBA与DAR的相关性
研究人员制备了目标DAR为2、4、6、7（各两份）及与参考标准一致的DAR 7.8的ADC-111样品，经ELISA确认抗原结合未受偶联过程影响。CBA测定的%RP与实验测定的DAR值呈现良好的线性相关（R2=0.99），证明ADC-111 CBA能够反映DAR变化。
4.4 ADC-111 CBA阶段适应性验证
在GMP实验室中进行的验证结果表明，ADC-111 CBA在35%至200%目标效力范围内具有良好的线性（R2=0.98，斜率=0.95），比例偏差为?3.5%。各目标水平的相对偏差最大为35%目标效力处的8.7%（90% CI：4.6，13.0）。合并所有样品的重复性%RSD为6.9%，中间精密度%RSD为7.5%。
4.5 RTU格式的ADC-111 CBA
研究人员评估了RTU格式的T24-Antigen-1+细胞在CBA中的应用。RTU格式即解冻WCB后直接计数使用，无需预先扩增培养。结果表明，CC和RTU两种格式产生了几乎相同的剂量-反应曲线、测定窗口和EC50，且测定性能高度可比，证明两种格式可在同一方法中整合使用。
4.6 利用T24细胞工程化表达其他肿瘤抗原的CBA
研究人员利用同一亲本细胞系T24分别工程化表达Antigen-2和Antigen-3，建立了ADC-222和ADC-333的CBA。两种CBA均产生了良好的剂量-反应曲线和测定特异性，成功验证了利用单一亲本细胞系开发多种ADC的CBA的概念。
五、讨论与结论
本研究成功开发并验证了基于T24-Antigen-1+细胞的ADC-111 CBA，该方法具有良好的特异性、线性、相对准确度、精密度和范围。ADC的CBA特异性面临多重挑战：膜通透性有效载荷和连接子-有效载荷本身具有细胞毒性，对于连接子不稳定的ADC尤为突出；细胞活力测定本身不具有ADC特异性。通过确保靶抗原高表达以区分非抗原依赖性杀伤，可有效提高特异性。细胞系选择是ADC CBA开发的另一关键考量，传统方法需要筛选肿瘤细胞系并评估抗原表达水平，资源消耗大，且天然肿瘤细胞系可能存在生长速率不稳定或生长缓慢导致测定孵育时间过长的问题。本研究展示了一种简化策略，即利用单一亲本细胞系工程化表达不同抗原以支持具有相似有效载荷的不同ADC的CBA开发，有助于标准化和加速ADC的CBA开发进程。
RTU细胞在效力测定中的应用可节省时间和资源，降低连续培养的污染风险，提高样品检测的排程灵活性，且RTU细胞库代表均一的细胞群体和传代次数，可降低连续培养中细胞变化的风险，简化实验室间的方法转移。ADC CBA特别适合RTU格式，可能归因于其所需细胞数量少且孵育时间较长，有利于细胞恢复。RTU的实施需考虑细胞库规模、冻存培养基、细胞密度、成本、存储空间和稳定性等因素。
关于ADC放行和稳定性检测组合中是否需包含抗原结合测定，目前在行业内仍存在争议。已有文献建议在早期临床阶段CBA尚未可用时可包含结合测定，但后期临床阶段和商业化阶段应包含CBA用于DS和DP控制。ADC的主要作用机制是通过抗原结合、内化和有效载荷释放导致细胞死亡，ELISA等结合测定仅捕获该过程的第一步，而CBA检测终点即细胞死亡，更能够反映作用机制。对于ADC-111，应激条件主要影响CDR区域，效力损失可由ELISA和CBA共同反映；而对于不影响CDR的DAR变异样品，效力损失仅由CBA反映而ELISA无法检测。ADC-111 CBA已证明能够同时覆盖抗体组分和偶联相关的关键质量属性，具有稳定性指示能力。基于放行、稳定性和强制降解研究获得的综合数据，将结合ELISA从ADC-111放行和稳定性检测组合中排除具有科学合理性。
