多交联光固化水凝胶经HIF-1/NF-κB双抑制实现干眼双效ROS清除与巨噬细胞重编程

《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》：Multi-crosslinked photocurable hydrogel for dry eye therapy: dual ROS scavenging and macrophage reprogramming for mitochondrial redox homeostasis and inflammation regulation through HIF-1/NF-κB Suppression

　　

随着空气污染加剧和电子设备使用增多，干眼（DE）发病率急剧上升，给视觉健康带来显著负担。鉴于其复杂发病机制和多因素病因，单一治疗方式难以获得最佳疗效。基于水凝胶的药物递送系统已受到广泛研究关注。本研究开发了一种兼具抗炎和抗氧化特性并采用先进多交联技术的光固化水凝胶（CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA），该新型制剂显著提高了疏水性免疫抑制剂环孢素A（CsA）的递送效率。此外，多巴胺（DA）的引入不仅提供强效抗氧化和活性氧（ROS）清除能力以应对眼表炎症性疾病，还赋予该多功能水凝胶系统优异的黏附性能。结果表明，CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA不仅能抑制核因子κB（NF-κB）信号通路激活、调节巨噬细胞极化并抑制结膜炎症浸润，还能抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号通路激活、调节葡萄糖代谢重编程、减少ROS产生，从而维持线粒体氧化还原稳态。综上所述，CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA对炎症和氧化应激的双重抑制作用有效改善DE恶性循环，增加泪液分泌，并显著缓解DE症状。

研究背景与问题：干眼（DE）是多因素眼表疾病，炎症和氧化应激相互强化，形成自放大的病理循环；巨噬细胞在诱导和调节DE炎症微环境中具有重要作用。CsA为钙调神经磷酸酶抑制剂，具有强免疫抑制及一定巨噬细胞调节作用，但作为高度疏水性环肽，临床递送受限。氧化应激及线粒体稳态失衡可加重DE眼表微环境失衡。现有眼滴受角膜上皮紧密连接、泪液和瞬目机械作用影响，吸收和利用度低。光固化水凝胶可在紫外或可见光下由液态转为固态水凝胶，具有载药、缓释和提高生物利用度优势；F127DA可自组装为纳米胶束增溶疏水药物，GelMA具有良好生物相容性和可调理化性质。该研究开发CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA多交联光固化水凝胶，旨在兼顾“眼滴给药”的非侵入便利性与角膜滞留、缓释及抗炎/抗氧化双效，论文发表于《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》。

关键技术方法概括：研究人员构建F127DA、DA-PEG-GelMA及CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA，采用FTIR、¹H NMR、LC-MS、DLS/Zeta电位、流变、Cryo-SEM、TGA、压缩、降解/溶胀及HPLC-MS释放与药代评价；以人角膜上皮细胞（HCECs）建立500 mOsM高渗（HS）和200 μM H₂O₂氧化应激模型，以RAW 264.7建立M1/M2极化模型；采用BAC诱导小鼠DE模型，结合活体成像、泪液分泌、角膜荧光素染色、活体共聚焦、光学相干断层扫描（OCT）、眼底照相/荧光素血管造影、H&E、PAS、TUNEL、油红及LipidTox染色，以及qRT-PCR、WB、免疫荧光、流式和RNA-seq/GSEA。HCECs与RAW 264.7购自ATCC；雌性C57BL/6小鼠购自上海SLAC。

研究结果：
3.1. Preparation and characterization of CsA@F127DA, DA-PEG-GelMA and CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA：经FTIR、¹H NMR及LC-MS验证合成与纯化；三种水凝胶透明，光固化后可见光透射率仍高；流变显示405 nm光照下快速凝胶化，CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA黏度最高且光交联更快；Cryo-SEM显示多孔网状且复合组孔隙最小，提示多交联结构；药物释放显示复合组缓释，CsA包封率约72.94%、载药量约0.72%。
3.2. Properties of CsA@F127DA, DA-PEG-GelMA and CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA：TGA显示两阶段热分解；复合组压缩模量最高；PBS中稳定性较好，胶原酶中DA-PEG-GelMA降解较快；复合组溶胀最小、含水量均>90%；DLS显示载CsA后胶束粒径增大，Zeta电位趋近中性；OCT显示复合组在角膜形成更平滑均匀弧形凝胶；兔角膜和房水HPLC-MS显示复合组CsA浓度高于Restasis?，提示缓释与滞留优势。
3.3. Biocompatibility and safety of CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA in vitro：以浸提液进行CCK8、结晶紫和活/死细胞染色，HCECs活力未受显著影响；405 nm光照10 s至3 min未见显著活力下降，提示体外安全性。
3.4. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA exerts antioxidant properties by protecting mitochondria under H₂O₂ oxidative stress：在H₂O₂模型中，复合组提高细胞活力、降低ROS，上调CAT、SOD1；Mito-Tracker、TMRE、TEM及ATP检测显示其改善线粒体分布、膜电位、形态和ATP生成，结论为保护线粒体并清除ROS。
3.5. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA exerts antioxidant properties by protecting mitochondria under HS stress：在500 mOsM HS模型中，复合组提高细胞活力与迁移，降低ROS并上调SOD2，改善线粒体形态、膜电位和ATP生成，结论为高渗应激下维持线粒体氧化还原稳态。
3.6. Anti-inflammatory properties of CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA：LPS/IFN-γ诱导RAW 264.7 M1，复合组降低NOS2、TNF-α、CD86并抑制M1极化；Transwell诱导M2模型中上调IL-10、CD206、Arg1；HCECs中降低IL-1β、IL-6、TNF-α并上调IL-13，结论为抑制M1、促进M2并减轻炎症。
3.7. Safety of CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA in vivo：裂隙灯、活体共聚焦、前节OCT、眼底照相、后节OCT及H&E未见明显眼组织异常；3个月重复剂量研究未见过敏或明显毒性变化。原文指出该3个月评价仅限大体形态，缺乏视网膜电图（ERG）和角膜神经密度定量，不能排除LAP诱导自由基的延迟光毒性可能，需长期研究。
3.8. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA alleviates DE：BAC诱导小鼠DE中，复合组增加泪液分泌、减少角膜荧光素染色、保护结膜杯状细胞、改善角膜共聚焦与OCT表现及H&E结构，结论为缓解DE症状并改善角膜屏障与结膜杯状细胞丢失。
3.8.1. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA maintains corneal redox balance：qPCR和免疫荧光显示复合组降低MMP3并提高HO-1、SOD1、CAT、SOD2；RNA-seq/GSEA提示富集于抗氧化、氧化应激及HIF-1信号；WB显示降低HIF-1α、HK1、PKM1并提高CS，TUNEL显示抑制角膜上皮细胞凋亡，结论为经HIF-1α抑制调节糖代谢并维持角膜氧化还原平衡。
3.9. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA maintains the immune homeostasis of the conjunctiva：结膜qPCR/免疫荧光显示复合组降低IL-1β、IL-6、IFN-γ，提高IL-13、MUC5AC，降低CD86并提高CD206；转录组GSEA提示NF-κB、TNF-α及巨噬细胞相关通路受抑；WB显示降低P-Iκβα、P-P65，结论为抑制NF-κB并促进M2极化、维持结膜免疫稳态。
3.10. CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA improves lipid secretion of meibomian gland：睑板腺显微观察、H&E、油红及LipidTox染色显示复合组改善腺体萎缩和脂质分泌，结论为改善睑板腺功能。

讨论与结论总结：该研究将CsA免疫抑制与DA抗氧化/黏附特性整合于多交联光固化水凝胶，经HIF-1α和NF-κB双通路抑制，连接氧化应激与炎症调控，打破DE恶性循环。原文同时指出长期安全性评价尚需ERG和角膜神经密度等指标。研究结论翻译：总之，本研究成功合成CsA@F127DA/DA-PEG-GelMA，并阐明其双重药理活性：通过抑制HIF-1信号通路改善角膜上皮葡萄糖代谢并维持线粒体氧化还原稳态，通过抑制NF-κB信号通路改善结膜炎症浸润。这些相互关联的调控轴编排了一个自我维持的修复循环，通过多维机制恢复眼表稳态，缓解DE模型小鼠症状。本研究不仅为DE病理机制提供新见解，也填补了光固化水凝胶作为DE药物递送系统的应用空白，为其眼科应用提供理论参考，并为其潜在用于治疗其他炎症性疾病或线粒体稳态障碍奠定基础。