靶向PfPyrKII的Skeletocutis来源真菌代谢物skeletocutin E实现恶性疟原虫双阶段抑制

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Dual-stage inhibition of Plasmodium falciparum by a Skeletocutis-derived fungal metabolite targeting pyruvate kinase II

　　

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）对当前一线治疗的耐药正威胁高风险人群，并凸显发现新型治疗靶点与药物的紧迫性。恶性疟原虫丙酮酸激酶I和II（pyruvate kinases I and II, PfPyrKI/PfPyrKII）是两种必需酶，在寄生虫内具有不同作用与亚细胞定位。PfPyrKI位于细胞质，而PfPyrKII位于顶质体（apicoplast），后者为顶复门（Apicomplexa）特有细胞器；PfPyrKII在该细胞器中参与生成维持顶质体所需的(d)NTPs。研究人员鉴定skeletocutin E——一种担子菌（basidiomycete）来源代谢物——为PfPyrKII的特异性抑制剂。skeletocutin E在体外以混合抑制机制（mixed inhibition mechanism）抑制PfPyrKII活性，IC₅₀为0.52 ± 0.08 μM，且不影响三种人丙酮酸激酶活性。利用合成skeletocutin E类似物开展构效关系（structure–activity relationship, SAR）分析，研究人员确定了该抑制作用的分子决定因素。此外，通过质量光度法（mass photometry）测定PfPyrKII四级结构（quaternary structure）显示，skeletocutin E不改变复合物分布，提示其不作用于亚基界面。研究人员考察PfPyrKII在肝期（liver stages）的表达并确认其顶质体定位。重要的是，skeletocutin E抑制恶性疟原虫在血期（blood stages）和肝期的生长，在红细胞（red blood cells）中IC₅₀为3.56 ± 0.50 μM，在原代人肝细胞（primary human hepatocytes）中为3.70 ± 0.74 μM。综上，这些发现确立PfPyrKII为可成药（druggable）的抗疟靶点，并鉴定skeletocutin E为合理开发双阶段抗疟疗法的有前景先导化合物（lead compound）。

恶性疟疾仍为全球重大公共卫生负担，2024年报告610,000例死亡，主要发生于5岁以下儿童；其病原体为顶复门（Apicomplexa）的疟原虫（Plasmodium），以恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）致死性最强。恶性疟原虫在人体内先经肝期在肝细胞内发育，再进入红细胞（red blood cells）内复制并引发疾病症状。自2009年大湄公河地区报告以青蒿素为基础的联合疗法（artemisinin-based combination therapies）治疗失败以来，抗性相关寄生虫突变已在东非出现，威胁疟疾死亡负担最重地区。因此，发现新治疗靶点、拓展作用机制不易与现有药物交叉耐药的抗疟药物管线十分必要。顶质体（apicoplast）为顶复门特有必需细胞器，参与肝期血红素与脂肪酸合成、红内期异戊二烯前体供给，并可能影响传播，因而被视为跨阶段治疗靶点。恶性疟原虫丙酮酸激酶I和II（PfPyrKI/PfPyrKII）为两种系统发育相距较远的必需酶：PfPyrKI为糖酵解酶并位于细胞质；PfPyrKII位于顶质体，非核苷特异，可磷酸化(d)NDP生成(d)NTP，为顶质体DNA复制、转录、翻译及Fe–S簇、脂肪酸和异戊二烯前体通路提供核苷酸。PfPyrKII此前被列为尚无抑制剂的优选治疗靶点之一。研究人员据此筛选化合物库与天然提取物库，寻找PfPyrK抑制剂，并评价其对寄生虫两个生活阶段的抑制作用。

关键技术方法：研究人员以重组PfPyrKI和去除含部分顶质体靶向肽N端序列的PfPyrKII开展偶联乳酸脱氢酶（LDH）的NADH氧化动力学实验，并以Lineweaver-Burk双倒数作图分析抑制类型；用质量光度法（mass photometry）分析PfPyrKII四级结构及skeletocutin E与底物的影响；按已有路线合成skeletocutin E及链长和端基类似物进行构效关系（SAR）分析；制备抗PfPyrKI和抗PfPyrKII抗体，以免疫荧光和顶质体标记ACP进行肝期共定位；采用恶性疟原虫3D7株红内期抑制试验（含血清及无血清短时暴露）和NF54子孢子（sporozoite）感染原代人肝细胞（primary human hepatocytes, PHH）的肝期抑制试验；NF54子孢子由Institut Pasteur的CEPIA平台提供。

研究结果：（1）重组PfPyrK的体外动力学性质：通过大肠杆菌表达、亲和纯化及尺寸排阻色谱获得(His)₆-PfPyrKI与无标签PfPyrKII；偶联酶实验显示两者均有活性，k_cat分别为2.64 × 10³ ± 1.50 × 10² min^?1与1.1 × 10⁴ ± 0.3 × 10⁴ min^?1。PfPyrKI对PEP和ADP呈S形动力学，S_0.5分别为0.101 ± 0.018与0.146 ± 0.014 mM，Hill系数n_H为1.31 ± 0.28与1.26 ± 0.14，提示正协同性；PfPyrKII对PEP呈双曲线动力学，S_0.5为0.059 ± 0.006 mM、n_H为1.13 ± 0.10，对ADP的S_0.5为0.072 ± 0.011 mM、n_H为1.29 ± 0.22，对GDP的S_0.5为0.095 ± 0.014 mM、n_H为1.09 ± 0.15；其ADP亲和力高于既往报道，k_cat/S_0.5为15,300 mM^?1min^?1。（2）PfPyrKII酶活性被skeletocutin E选择性抑制：以suramin为阳性对照，其对PfPyrKI的IC₅₀为7.02 ± 2.17 μM、K_i为2.87 μM，对PfPyrKII的IC₅₀为2.81 ± 0.772 μM、K_i为1.14 μM。筛选法国Muséum National d’Histoire Naturelle化学库与天然提取物库后，最有效分子MNHN-CH-0561即skeletocutin E，其为14碳链两端连接两个citraconic anhydride的担子菌代谢物类似物。30 μM时PfPyrKI残余活性70.1 ± 7.92%，PfPyrKII残余活性10.9 ± 3.77%；skeletocutin E抑制PfPyrKII的IC₅₀以ADP为底物为0.52 ± 0.08 μM、以GDP为底物为0.77 ± 0.08 μM。人PKM1、PKM2和PKR在30 μM时残余活性分别约82.7 ± 2.74%、84.2 ± 8.22%和82.3 ± 11.5%，显示对寄生虫靶点的选择性。（3）skeletocutin E抑制PfPyrKII的机制：Lineweaver-Burk分析显示其为混合抑制；0.4 μM抑制剂使PfPyrKII最大初速度降低4.30 nmol/min，ADP的S_0.5降低2.29倍、PEP的S_0.5降低1.53倍。K_ic大于K_iu，对PEP-PfPyrKII复合物亲和力0.16 μM、对无PEP的PfPyrKII为0.31 μM，对ADP-PfPyrKII复合物为0.11 μM、对无ADP的PfPyrKII为0.42 μM，提示结合位点不在催化袋。（4）PfPyrKII的四级组织及skeletocutin E对其调节：质量光度法显示PfPyrKI以同源四聚体为主，并见单体与二聚体；PfPyrKII出现63、198、328与446 kDa四个主要峰，分别对应单体、二聚体、三聚体与四聚体，单体、二聚体与四聚体比例相近，三聚体较少。加入DMSO后各形式表观质量上移但分布不变；加入25 μM skeletocutin E或先孵育后检测，均未显著改变四级结构分布；加入ADP与PEP亦未改变各形式平衡。结论为skeletocutin E不干扰亚基界面。（5）类似物对PfPyrK2的抑制：citraconic anhydride单独无抑制作用；仅含单个citraconic anhydride的chaetomellic anhydride A无抑制活性；缩短碳链降低对PfPyrKII的抑制，较skeletocutin E少4个碳时IC₅₀升至10 μM以上，少1个碳亦升高；延长碳链未与IC₅₀差异相关；PfPyrKI活性在各类似物10 μM下维持75%–85%。因此最佳抑制分子需两个环及至少14个碳的间隔链。（6）恶性疟原虫肝期中PfPyrKI和PfPyrKII的免疫标记：制备大鼠抗PfPyrKI与豚鼠抗PfPyrKII抗体，Western blot确认特异性且无交叉反应；在体外肝期第5天和第6天免疫荧光显示PfPyrKI呈细胞质定位，PfPyrKII与顶质体酰基载体蛋白（ACP）信号重叠，双染无重叠，首次显示两酶在肝期表达且PfPyrKII定位顶质体。（7）对人肝细胞中恶性疟原虫生长的抑制：以NF54子孢子感染PHH并在接种时给予0.6–40 μM skeletocutin E预防性处理6天，寄生虫呈剂量依赖性减少，40 μM时几乎清除肝内虫体；IC₅₀为3.7 ± 0.8 μM，5 μM时虫数较对照下降59.15 ± 4.80%，剩余虫体尺寸亦减小；阳性对照primaquine的IC₅₀为0.29 ± 0.1 μM；同浓度范围对PHH无毒性。citraconic anhydride、chaetomellic anhydride A与compound 3无肝期抑制；skeletocutin M虽与skeletocutin E相似抑制PfPyrKII，却不损害PHH内虫体发育。（8）对人红细胞中恶性疟原虫生长的抑制：含血清培养48 h未见skeletocutin E抑制，96 h仅见弱抑制，呈延迟死亡倾向；改用无血清和无AlbuMAX短时6 h暴露后回到完全培养基一个红内期，skeletocutin E呈剂量依赖性抑制，IC₅₀为3.56 ± 0.50 μM；氯喹在该短时暴露方案下IC₅₀为57.9 ± 4.6 nM；未感染红细胞无溶血，≥2.5 μM时见致密变形虫体，提示严重发育停滞；该6 h方案不能评价延迟死亡表型。

讨论部分总结：作者强调顶质体在疟原虫各生命周期阶段均必需，肝期涉及血红素和脂肪酸合成，红内期提供异戊二烯前体，并可能影响配子体与传播；因顶质体内共生起源，PfPyrKII与哺乳动物PyrK系统发育距离远，具有非核苷特异、蛋白较大及四级结构分布独特等可 exploited 特征。研究证实重组两酶有活性，并指出解冻后短暂离心及PfPyrKII异常四级平衡可能解释其动力学数据与既往报道差异。skeletocutin E为强效选择性PfPyrKII抑制剂，较此前报道的procyanidin A1（347 μM时90%抑制）更有效，且不抑制PfPyrKI及PKM1、PKM2、PKR；PKL未直接检测，但PKL为PKR同工型，且40 μM对肝细胞无细胞毒，提示不干扰PKL。机制与质量光度结果提示skeletocutin E结合于催化袋和亚基界面之外，精确结合仍需结构研究；PfPyrKII尚无实验结构，AlphaFold预测显示A、B、C结构域高置信，N端延伸及两个无序环低置信，顶质体靶向信号是否切除非本研究可定。skeletocutin E来源于肯尼亚木生担子菌Skeletocutis，tyromycin A等类似物具抗菌和抗HCV活性且对多种哺乳细胞低毒，与本研究无细胞毒一致；其对疟原虫有效浓度低于细菌或HCV，提示对恶性疟原虫的选择性毒性。肝期和红内期IC₅₀同数量级，提示代谢有限且靶点可及性相似；肝期PfPyrKII需求尚未直接证明，但其(d)NTP产物可能用于DNA和RNA合成，其他依赖ATP通路也可能受影响。肝期抑制呈逐渐减弱生长，需约60倍浓度从部分到完全抑制，且尺寸下降出现于更高浓度，作者认为可能反映多靶点作用，不能排除其他靶点。红内期观察到的即时死亡提示其作用不止于顶质体维持，与异戊二烯前体合成一致；高浓度仅见延迟死亡倾向，作者设想若细胞内靶向PfPyrKII，其作用可能兼具即时和延迟效应。未来开发应聚焦于通过合理修饰或靶向递送提高其在人血清或白蛋白丰富环境中的生物利用度。

研究结论部分翻译：综上，这些发现确立PfPyrKII为可成药的抗疟靶点，并将skeletocutin E鉴定为合理开发双阶段抗疟疗法的有前景先导化合物。因此，作为一种靶向新治疗酶并抑制恶性疟原虫多个发育阶段的化合物，skeletocutin E是一个原创且有前景的候选物，值得进一步探索以开发为新型抗疟药，并可能限制耐药性的出现。