帕金森病相关基因改变破坏黑腹果蝇的行为与昼夜活动

《Behavioural Brain Research》：Parkinson's Disease-Associated Genetic Alterations Disrupt Behavior and Diurnal Activity in Drosophila melanogaster

　　

• PARK基因改造在果蝇中产生了不同的行为表型。
• PARK1、PARK2、PARK6和PARK7差异性改变了饥饿耐受性。
• PARK基因改造改变了运动行为和昼夜活动模式。
• 行为改变和昼夜节律改变在果蝇中表现出性别依赖性差异。
• 一个假设生成模型提出了PARK通路、多巴胺功能障碍和昼夜节律调节之间的潜在联系。

## 引言

帕金森病（PD）是第二大常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元的进行性丧失，导致运动功能受损以及多种非运动症状[1], [2], [3]。多巴胺能神经元的退化破坏了基底节网络并改变了调节自主运动的神经传递[4]。因此，运动通路的激活受损导致PD的特征性运动功能障碍症状，包括运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势不稳[5], [6], [7]。果蝇模型中也报道了类似的运动障碍和多巴胺功能障碍，支持其在研究帕金森病分子机制方面的应用价值[8], [9]。

PD的病理学不仅局限于纹状体多巴胺的耗竭，还涉及多种神经递质系统和神经调节因子对神经退行性过程的贡献[10]。多巴胺能神经元的进行性丧失伴随着α-突触核蛋白的异常积累和聚集，导致路易小体的形成，这是PD的病理标志之一[11], [12], [13]。聚集的α-突触核蛋白也被认为与多种其他神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病和唐氏综合征[14]。

PD的病因是多因素的，涉及环境和遗传因素之间复杂的相互作用。环境危险因素，特别是农药暴露和头部外伤，连同遗传基因突变，共同促进了PD的发生发展[8], [9], [15], [16], [17]。这些因素促进了线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质稳态受损和溶酶体功能障碍，最终导致多巴胺能神经元退化[12], [18], [19], [20]。尽管约90%的PD病例为散发性，但近10%与遗传性基因突变有关，这为了解疾病发生发展的分子机制提供了宝贵的见解[21]。

在PD相关基因中，α-突触核蛋白（SNCA）、parkin（PRKN）、PINK1和DJ-1因其在中枢神经存活、线粒体质量控制、氧化应激调节和蛋白质降解中的关键作用而备受关注。了解这些基因遗传变异的生物学后果对于阐明PD的分子机制至关重要。黑腹果蝇已成为研究神经退行性疾病的优秀实验模型，因为约75%的人类疾病相关基因在果蝇中具有功能同源基因[22], [23], [24]。此外，果蝇拥有相对复杂的神经系统，具有保守的分子通路，涉及神经元发育、神经传递和神经退行[25]。更具体地说，果蝇大脑含有约120-150个多巴胺能神经元，便于研究PD相关的神经元退化和行为功能障碍[8], [26]。先前的研究还表明，环境毒素，包括农药，会在果蝇中诱发氧化应激和多巴胺能神经元退化，导致PD相关的行为表型[8], [9], [27]。

为了研究帕金森病底层的分子机制，已开发了多种携带PD相关基因改造的果蝇品系。本研究使用的果蝇品系代表了PD的不同遗传病因，包括人类α-突触核蛋白的神经元表达（SNCA；PARK1）以及parkin（PRKN；PARK2）、PINK1（PINK1；PARK6）和DJ-1β（DJ-1；PARK7）的功能缺失突变。这些模型表现出行为学和神经退行性表型，与PD的多个关键病理特征相似，已成为研究疾病机制的有价值工具。

PARK1是由α-突触核蛋白（SNCA）基因突变引起的常染色体显性遗传型PD[28]。α-突触核蛋白是一种丰富的突触前神经元蛋白，在突触囊泡转运、神经递质释放和突触可塑性中起关键作用[29]。在生理条件下，α-突触核蛋白主要以可溶性形式存在；然而，错误折叠和寡聚化会促进氧化应激、线粒体功能障碍和神经元退化，最终导致路易小体形成[12], [30]。本研究使用的PARK1模型是通过使用elav-GAL4驱动子在有丝分裂后神经元中表达人类α-突触核蛋白（SNCA）产生的。

PARK2是由parkin基因突变引起的常染色体隐性遗传青年型PD[11]。该基因编码一种E3泛素连接酶，在泛素介导的蛋白质降解和线粒体质量控制中发挥重要作用。尽管其精确的生物学功能仍在研究中，但大量研究表明parkin保护多巴胺能神经元免于退化，并有助于维持线粒体完整性[31]。parkin功能缺失导致线粒体异常、肌肉退化、运动行为受损和进行性神经元功能障碍，所有这些均类似于PD的病理特征[32]。本研究使用的PARK2果蝇品系携带parkin基因的缺失，从翻译起始位点的5'端延伸至基因3'端外约1 kb处，导致产生缺失等位基因[32], [33]。

PARK6也是一种常染色体隐性遗传青年型PD，由编码PTEN诱导的假性激酶1（PINK1）的基因突变引起，PINK1是一种在线粒体质量控制中发挥关键作用的线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶[17], [34]。PINK1与parkin协同功能调节线粒体自噬和维持线粒体稳态[35]。PINK1或parkin的突变会破坏该通路，导致线粒体肿胀、活力降低、线粒体形态异常和神经元功能受损[36], [37]。本研究使用的PARK6果蝇品系携带P元素不精确切割导致PINK1序列缺失从而产生功能缺失的突变，进而导致线粒体功能障碍。

PARK7也是一种由DJ-1基因突变引起的常染色体隐性遗传青年型PD[38]。DJ-1是一种多功能蛋白，在细胞对氧化应激的保护、线粒体功能调节和神经元存活维持中发挥重要作用。DJ-1在与PINK1-parkin复合物共享的共同通路中发挥作用，已被证明至少可以在一定程度上补偿PINK1功能的丧失[39]。因此，DJ-1突变产生的病理和行为表型与PARK2和PARK6模型中观察到的相似，包括线粒体功能障碍、氧化应激和进行性神经退行性变[40], [41]。本研究使用的PARK7果蝇品系携带DJ-1β编码序列的缺失，导致DJ-1功能丧失。

越来越多的证据表明，PD不仅是一种运动障碍，还涉及昼夜节律、睡眠-觉醒调节、运动活动、代谢和其他非运动功能紊乱。尽管果蝇模型被广泛用于研究PD，但很少有研究在相同的实验条件下系统地比较多个PARK相关遗传模型的压力耐受性、幼虫运动行为、成虫运动表现和昼夜活动模式。

本研究通过评估黑腹果蝇中PD相关基因改造的行为后果来弥补这一知识空白。具体而言，我们调查了四种代表不同PD相关遗传机制的已建立的果蝇品系中的饥饿应激耐受性、幼虫垂直迁移、成虫负趋地性、跳跃行为和昼夜运动活动。

我们假设这些PD相关基因改造差异性影响果蝇的应激耐受性、运动行为和昼夜活动节律的调节。由于PD在发病率、进展和临床表现方面表现出性别特异性差异，我们也调查了雌雄果蝇之间的行为差异，以确定性别是否影响PD相关基因改造的表型后果。总之，本研究对四种广泛使用的果蝇PD品系进行了全面的行为比较，并为未来研究PD基因功能障碍与应激反应、运动缺陷和昼夜活动失调之间联系的分子机制奠定了基础。

## 方法片段

### 果蝇品系与维护

野生型w111?果蝇被用作对照，同时从Bloomington果蝇品系中心（美国印第安纳州Bloomington）获取PD相关果蝇品系。为最大限度减少遗传背景差异，我们将所有转基因和突变果蝇品系与w111?进行至少7代的回交。尽管这种回交策略最大限度地减少了遗传背景差异，但我们并未独立确认品系的一致性。

### PARK1果蝇品系

（品系编号#8146：w[*]；...

### 帕金森病相关果蝇模型中的差异性压力耐受性

饥饿实验揭示了帕金森病相关果蝇模型之间的生存差异存在基因型依赖性（图1A, B）。Kaplan-Meier生存分析显示，雄性和雌性果蝇的基因型生存曲线之间均存在显著总体差异（log-rank [Mantel-Cox]检验，雄性P = 0.039；雌性P = 0.0027）。

在雄性中，中位生存时间分别为：w111?为75小时，PARK1为89小时，PARK2为53小时，PARK6为89小时，PARK7为65小时。与野生型中位数相比，PARK1和PARK6...

## 讨论

本研究以黑腹果蝇为模型系统，调查了PD相关基因突变的行为后果。我们的发现揭示了四种PD相关遗传模型在应激耐受性、幼虫和成虫运动行为以及日常活动模式方面产生了显著改变。结果表明，这些PD相关遗传模型中的运动和昼夜节律行为发生了改变。

应激耐受性实验揭示，不同的PD相关...

## 基金

本研究未收到公共、商业或非营利部门任何基金机构的专门资助。

## 伦理声明

本研究使用果蝇Drosophila melanogaster，一种无脊椎模式生物。根据当前的机构和美国法规指南，涉及果蝇的实验不属于机构动物护理和使用委员会（IACUC）审批范围。所有实验均按照无脊椎研究生物伦理使用和护理的既定实验室实践进行。

## CRediT作者贡献声明

Natraj Krishnan：撰写——审阅与编辑，形式分析。
Subhodeep Mitra：撰写——审阅与编辑，调查，形式分析。
Kimberly Lackey：撰写——审阅与编辑，形式分析。
Cole Witte：撰写——审阅与编辑，调查，形式分析，数据整理。
Anathbandhu Chaudhuri：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，项目管理，方法论，形式分析，数据整理，概念构思。

## 生成式人工智能及AI辅助技术声明

在撰写本文过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）协助进行英语语言编辑、语法精炼、提高手稿可读性以及完善提议的示意图说明（图7）的呈现方式。使用此工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

## 利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

## 致谢

作者衷心感谢Bloomington果蝇品系中心（美国印第安纳大学，印第安纳州Bloomington）提供了本研究中使用的果蝇品系。我们也感谢所有在本研究过程中提供技术协助和有 discussions的人。

Cole Witte | Subhodeep Mitra | Kimberly Lackey | Natraj Krishnan | Anathbandhu Chaudhuri