《Biochemical Pharmacology》：Apatinib attenuates CRKII-Mediated angiogenesis: Possible implications for metastasis prevention from small extracellular vesicle proteomics
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摘要术后高复发率严重影响了三阴性乳腺癌（TNBC）手术的治疗效果。我们研究了阿帕替尼作为辅助疗法的潜力，该疗法针对肿瘤微环境中的小外泌体（sEV）介导的血管生成，以识别新的预后生物标志物。我们采用定量无标记蛋白质组学方法筛选TNBC来源的sEV中的关键治疗靶点。通过体外功能检测（
摘要
术后高复发率严重影响了三阴性乳腺癌（TNBC）手术的治疗效果。我们研究了阿帕替尼作为辅助疗法的潜力，该疗法针对肿瘤微环境中的小外泌体（sEV）介导的血管生成，以识别新的预后生物标志物。我们采用定量无标记蛋白质组学方法筛选TNBC来源的sEV中的关键治疗靶点。通过体外功能检测（增殖、迁移、黏附、侵袭和管状形成）和体内 TNBC同基因小鼠模型，评估了阿帕替尼的抗血管生成效果和潜在的抗转移活性。为了验证其转化潜力，我们分析了CRKII-PXN/VEGFA轴的调控及其与肿瘤血管生成和生长抑制的相关性。蛋白质组学分析发现，适配蛋白CRKII在sEV中显著下调。机制上，阿帕替尼通过减少sEV-CRKII（小外泌体-CRKII）来干扰促血管生成信号向内皮细胞的传递，从而抑制下游的CRKII-PXN/VEGFA信号通路。功能验证证实，CRKII的下调模拟了阿帕替尼的抗血管生成效果，而其过表达则逆转了这一效果。在临床前模型中，阿帕替尼显著抑制了肿瘤生长并降低了微血管密度，表明其在控制肿瘤负担和潜在微转移方面的有效性。阿帕替尼通过下调sEV-CRKII并阻断CRKII-PXN/VEGFA轴有效抑制TNBC的血管生成并表现出潜在的抗转移活性。这些发现表明，阿帕替尼可能作为术后辅助疗法用于预防转移。此外，sEV-CRKII成为外科医生监测TNBC患者治疗反应和复发风险的有希望的非侵入性生物标志物。
引言
三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌病例的15-25%，其特征是缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER-2受体的表达[1] [2]。这种亚型在年轻人群中较为常见，其特征是高组织学分级、频繁转移和复发以及较差的预后[3] [4] [5]。目前，转移性TNBC的标准治疗是化疗。新型治疗模式的出现，包括抗血管生成药物、免疫检查点抑制剂和抗体-药物偶联物，显著改善了患者的生存结果[6] [7]。
阿帕替尼甲磺酸盐是一种口服的第二代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。与通过注射给药的大分子单克隆抗体药物相比，小分子TKI阿帕替尼采用口服制剂，使用方便。它对晚期TNBC表现出显著的临床益处，但其详细的作用机制仍需进一步阐明[8] [9]。一项II期研究评估了阿帕替尼单药治疗（750 mg/天，28天周期）治疗晚期TNBC的疗效：在25名入组患者中，22名可评估患者的客观反应率为36.4%，疾病控制率为59.1%（包括22.7%的疾病稳定），中位无进展生存期（mPFS）为4.6个月，中位总生存期（mOS）为8.3个月[10]。我们中心的临床实践也证明了阿帕替尼与化疗联合使用在治疗转移性TNBC方面的高疗效和良好安全性[11]。这些数据证实了阿帕替尼对晚期TNBC的临床益处，但其具体作用机制仍不清楚。
肿瘤生长不仅依赖于癌细胞的固有倾向，还依赖于肿瘤微环境（TME）内的复杂细胞间通信。现在认识到，直径为30-150纳米的小外泌体（EVs）是这种通信的关键介导者[12] [13]。肿瘤细胞来源的sEVs作为关键的“信使”，促进肿瘤血管生成。它们像快递员一样包装各种促血管生成的活性分子——主要是蛋白质和非编码RNA——并将其递送到血管内皮细胞。通过激活一系列信号通路，它们刺激内皮细胞的增殖、迁移和新血管网络的形成，从而为肿瘤生长和转移提供必要的氧气和营养[14] [15]。
小外泌体（sEVs）的蛋白质组学分析在乳腺癌研究中取得了显著进展，包括加速诊断生物标志物的发现和精确肿瘤亚型的精细化。通过分析患者体液（如血液）中的外泌体蛋白，研究人员致力于识别早期诊断和亚型区分的特异性标志物。例如，血浆来源的外泌体中的组蛋白H2A以及细胞外泌体中的PXDN和GGT5显示出作为候选生物标志物的潜力[16] [17]。同时，通过比较不同乳腺癌亚型细胞系的外泌体蛋白谱，已经鉴定出一种由33种蛋白质组成的特征组合，可以有效地区分亚型[18]。此外，这项技术为识别药物靶点和阐明治疗机制提供了新的视角。例如，我们的研究小组之前通过外泌体蛋白质组学分析表明，化疗药物纳曲妥昔单抗（Nab-PTX）显著抑制了来自三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的外泌体中的CYR61蛋白，并通过CYR61/Integrin αvβ3信号通路抑制血管生成[19]。这一发现不仅揭示了该药物的新作用机制，还为靶向治疗提供了潜在的新靶点。
在这项研究中，我们首先证实阿帕替尼有效抑制内皮管状形成以及MDA-MB-231细胞的迁移、黏附和侵袭。基于这一发现，我们利用sEV蛋白质组学系统地识别并表征了阿帕替尼的分子靶点，发现适配蛋白CRKII在阿帕替尼介导的这些细胞过程抑制中起关键作用。我们进一步推测这种调节效应是由CRKII-PXN/VEGFA信号通路介导的。
章节片段
细胞培养和试剂
MDA-MB-231细胞来自美国类型培养收集中心（ATCC，CRM-HTB-26），并在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基（C11995500BT，GIBICO）中于37°C下培养，气体交换自由，大气空气。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自上海同湃生物技术有限公司，在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的ECM中于37°C和5% CO2环境中培养。4 T1
阿帕替尼的细胞毒性及其对MDA-MB-231细胞形态的影响
阿帕替尼在MDA-MB-231细胞中的IC50值分别为12小时、24小时和48小时的62.74 μM、49.96 μM和16.13 μM。在24小时时，BT549细胞的IC50值为34.63 μM，4 T1细胞的IC50值为63.5 μM。相比之下，阿帕替尼在12小时时对HUVEC细胞几乎没有细胞毒性（图1A）。随着阿帕替尼浓度的增加，黏附细胞的数量减少，剩余细胞表现出拉长、丝状的外观（图1B）。此外，细胞骨架
讨论
阿帕替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，选择性地靶向血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）。目前，阿帕替尼在三阴性乳腺癌（TNBC）中的应用已取得显著进展，临床实践主要集中在两个主要阶段：新辅助治疗[23]和晚期治疗[11]。在基础研究中，阿帕替尼已被证明能抑制乳腺癌干细胞的干性特性和恶性生物学行为
魏世琴：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，数据分析，概念化。梅媛：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，数据分析，概念化。刘春江：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，数据分析。黄伟伟：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。于素红：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。
资助
本研究得到了吴洁平医学基金会临床研究专项基金（资助编号：320.6750.2021–14-6）、福建省自然科学基金（资助编号：2023 J011275）、福建省科技创新联合基金（资助编号：2023Y9431, 2020Y9039）和福建省癌症医院课题（资助编号：F2326Y-YZK03-01）的支持。资助者在研究设计、数据收集与分析、发表决定等方面没有任何作用
伦理声明
所有动物实验均获得了机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号：2024-SG-057），所有方法均符合ARRIVE指南。
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
作者感谢复旦大学化学系和生物医学科学研究所、人民共和国的技术支持。
魏世琴|梅媛|刘春江|黄伟伟|于素红
