m6A的单细胞与空间表观转录组学：技术、调控机制及生物学见解

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：Single-cell and spatial epitranscriptomics of m6A: Technologies, regulatory mechanisms, and biological insights

　　整体摘要（要点）：- 整体式m6A图谱会把细胞类型的异质性平均掉，从而掩盖了具有生物学意义的表观转录组多样性。- 单细胞m6A技术能够在单个细胞分辨率下解析METTL3驱动的修饰景观。- 空间表观转录组学能够在完整的组织结构中绘制METTL3活性及"阅读器"（reader）的表达分布。- 细胞类型特异性的阅读器蛋白表达决定了METTL3所沉积的m6A标记的最终功能命运。引言转录调控是决定基因表达的主要因素，它协调转录因子、染色质结构以及表观遗传机制。单细胞和空间转录组学的发展揭示了这些调控程序在不同细胞和组织中的差异。然而，转录的生物学效应并不止于RNA合成，新生转录的RNA还会经历广泛的转录后调控。在这些机制中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物信使RNA中最常见的内部修饰，它调控RNA的加工、稳定性、定位与翻译[1]。m6A将转录产物与依赖于上下文的转录本命运联系起来，构成了连接基因表达与细胞表型的重要表观转录组层级。m6A在整个转录组中有成千上万个位点，尤其集中在保守的RRACH共识基序中（其中R代表A/G，H代表A/C/U），常见于终止密码子附近及3′非翻译区（UTR）内。约25%的人类mRNA转录本含有此修饰，m6A是转录后基因表达的枢纽[2]、[3]、[4]。与其他RNA修饰相比，m6A丰度高、可逆，并能响应发育信号、环境刺激和疾病状态进行动态调控，因此构成了灵活的转录后调控层。处于这一调控网络中心的是甲基转移酶样蛋白3（METTL3），它是哺乳动物m6A"书写者"复合物的活性催化亚基，也是负责在mRNA上沉积m6A的主要组分[5]、[6]。尽管m6A调控涉及"书写者—阅读器—擦除者"（writers/readers/erasers）的网络，METTL3在该调控轴中仍处于核心位置，因为它催化了哺乳动物mRNA中大多数内部m6A的沉积，并启动决定转录本命运的下游调控级联。m6A的功能后果取决于细胞环境，特别是阅读器蛋白的表达以及组织内的空间组织方式。因此，最新的单细胞与空间表观转录组学技术对于理解METTL3介导的m6A沉积如何在不同细胞类型、发育阶段和组织微环境中被差异解读尤为关键[7]、[8]、[9]。METTL3并非独立发挥作用：阅读器识别m6A并决定下游转录本命运，而擦除者移除该修饰[4]。三者共同构成一个动态的调控轴，其功能输出不仅取决于m6A沉积的位置，也取决于细胞环境[10]。另一方面，在高表达YT521-B同源结构域家族2（YTHDF2，主要的m6A降解阅读器）的细胞中，METTL3沉积的m6A作为转录本命运的重要决定因素，引导转录本经碳代谢物抑制负调控TATA-less（CCR4-NOT）去腺苷酸化酶复合体迅速降解[6]、[11]、[12]。相反，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP）等非常规阅读器的表达会促进转录本稳定性和翻译[13]。因此，尽管METTL3建立了m6A标记，其功能结果却由解读该修饰的细胞调控环境所决定。这些生物学上的悖论并非完全由m6A所决定，因而不同效应的产生与解码该修饰的细胞机器密切相关。这意味着同样的转录产物，根据阅读器和擦除者的背景不同，可能导致截然不同的表型后果。因此，METTL3提供了一个核心的概念框架，用以理解一种共同的m6A信号如何被翻译为不同细胞背景下的不同转录本命运。为解决这一变异性，需要具备在细胞和空间分辨率下解析m6A调控的工具。单细胞和空间表观转录组学的最新进展使得更精确地刻画这种异质性成为可能。这些方法通过解析METTL3介导的甲基化发生的细胞与空间背景，为将m6A沉积与最终决定其功能后果的阅读器与擦除者景观联系起来提供了途径。单细胞m6A图谱技术，包括"RNA修饰位点邻近去氨基化单细胞测序"（scDART-seq）与"sn-m6A-CUT&Tag"（sn-m6A-CT），可在单细胞分辨率下实现全转录组范围的m6A分析；而空间方法则保留解剖学背景，允许研究者观察特定m6A调控程序在组织内的具体发生位置。章节摘要书写者复合物：位于中心的METTL3在哺乳动物mRNA上沉积m6A主要由METTL3–METTL14甲基转移酶复合物催化，其中METTL3提供催化活性，METTL14支持其构象与底物结合[14]、[15]。该复合物优先在RRACH基序处沉积m6A，并结合包括Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白（VIRMA）、锌指CCCH型结构域蛋白13（ZC3H13）以及RNA结合基序蛋白等辅助因子。用于单细胞与高分辨率m6A RNA图谱的新技术单细胞m6A技术的发展从解析修饰异质性逐步走向保留组织结构，并将表观转录组信息与其他互补分子模态相整合。2012年开发的甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）通过在RRACH基序、终止密码子附近及3′ UTR区域的富集以及在不同生物学条件下动态调控的揭示，实现了全转录组范围的m6A图谱绘制。单细胞与高分辨率m6A技术的应用单细胞与高分辨率m6A图谱将RNA甲基化分析从群体水平拓展到解析细胞异质性，并使对稀有生物样本的研究成为可能。高通量方法如scDART-seq与sn-m6A-CT适用于细胞类型和细胞状态特异的图谱分析；而低输入方法如scm6A-seq和picoMeRIP-seq则能对单个卵母细胞、胚胎及其他RNA受限的样本进行分析[38]、[39]、[50]、[51]。因此……胚胎发生与早期发育早期胚胎发育是单细胞m6A图谱产生最直接、最具变革性机制洞察的生物学背景。METTL3长期以来被认为对早期发育不可或缺：在 mice 中雌性生殖囊卵母细胞特异敲低会严重损害卵母细胞成熟并扰乱母体到合子的转换（MZT）[59]。重要的是，这些发育体系也凸显了低输入m6A技术的价值，因为……阅读器景观：细胞类型特异性表达如何塑造METTL3输出单细胞表观转录组学揭示的最重要洞见是：METTL3并不能单独决定RNA的命运。同一转录本上的同一m6A标记，在一个细胞类型中可能驱动降解，在另一个中促进翻译，在第三个中则使其稳定，这完全取决于局部的阅读器景观。这种调控在整体实验中难以被观察，因为整体实验会将不同阅读器表达的细胞信号平均化。不同细胞类型之间YTHDF表达模式的差异……挑战、局限与未来展望尽管已有重大进展，单细胞和空间表观转录组学仍受限于敏感性低、定量不确定以及方法学差异。由于m6A仅占细胞内腺苷的一小部分，且单细胞提供的RNA输入极为有限，当前方法往往只能生成稀疏且波动的甲基化图谱，使得细胞间的定量比较变得困难。基于抗体的方法还存在非特异性结合等方面的担忧。结论单细胞与空间表观转录组学将m6A研究从群体水平的图谱绘制推向了对METTL3介导调控如何在不同细胞状态、发育阶段和组织微环境中变化的理解。尽管METTL3与共转录过程同步沉积m6A，但该修饰的功能结果并非预先决定，它强烈依赖于阅读器的可及性、细胞状态、转录本身份以及亚细胞定位。相反的功能活动……CRediT作者贡献声明Oishi Mukherjee：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、软件、方法、调查研究、数据整理。Koustav Sarkar：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、验证、监督、资源、项目管理、经费获取、概念构思。伦理批准不适用。写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明本工作的撰写过程中，作者使用了Grammarly与GPT-5.6 Luna以提高稿件的清晰度与可读性。使用该工具/服务之后，作者对内容进行了审阅和必要编辑，并对已发表论文的内容承担全部责任。资助本综述文章由印度医学研究委员会（Indian Council of Medical Research，ICMR，印度政府）资助（ICMR项目编号：IIRP-2023-5901；批准令号：EMDR/SG/15/2023–5901）。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文工作的已知财务利益冲突或个人关系。致谢作者感谢SRM科学与技术学院为本工作的开展提供了必要的科研环境支持。Oishi Mukherjee｜Koustav Sarkar