Macrophomina phaseolina分泌代谢物中(?)-botryodiplodin对HSV-1的转录前抑制作用及天然化学骨架价值

《Scientia Pharmaceutica》：Antiviral Activity of Metabolites from Macrophomina phaseolina Against Herpes Simplex Virus 1

　　

Macrophomina phaseolina是一种全球分布的死体营养型真菌，已成为生物活性天然产物的来源。本研究评估了M. phaseolina代谢物对1型单纯疱疹病毒（HSV-1）的抗病毒潜力。从培养基中获得M. phaseolina粗提物，并采用色谱技术纯化分泌型代谢物。采用核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）技术鉴定主要代谢物。利用Vero细胞并通过定量聚合酶链反应（qPCR）进行病毒定量，评估这些代谢物的抗病毒活性。此外，采用qPCR进行病毒基因表达和胞内基因组定量。分离得到6种代谢物：(?)-botryodiplodin、mellein、hydroxymellein、acetylphomalactone、asperlin和isoasperlin。通过NMR和HRMS解析其结构。多数代谢物抗病毒效果有限；然而，(?)-botryodiplodin表现出强效活性，半数有效浓度（EC₅₀）为2.44 μg/mL，选择性指数（selectivity index，SI）为4.79。此外，加入阿昔洛韦作为对照，显示>97%的抗病毒抑制。机制研究表明，(?)-botryodiplodin抑制HSV-1产生、降低病毒基因组水平，并抑制立即早期、早期和晚期病毒基因表达。这些发现表明，(?)-botryodiplodin作为HSV-1在病毒转录之前的早期阶段抑制剂发挥作用，使该天然代谢物成为合理设计新型抗病毒药物的有前景化学骨架。

论文解读

研究背景：Macrophomina phaseolina（一种全球分布的死体营养型真菌）具有广泛环境适应性，其基因组约50 Mb，约15,000个预测基因，其中约75个与次生代谢相关；该菌可产生与致病性相关的植物毒性代谢物，也被视为生物活性代谢物的来源。已有从该菌鉴定的多种代谢物具有抗真菌、抗菌和抗肿瘤等活性。1型单纯疱疹病毒（HSV-1）全球估计感染率约67%，可引起潜伏感染和皮肤、口唇、眼及生殖器复发损害，并可导致脑炎、脑膜炎、新生儿疱疹及免疫低下者广泛感染。阿昔洛韦及其衍生物需经病毒胸苷激酶（TK）激活并抑制病毒复制，但已有耐药株报道，因此需要新的作用机制和治疗策略。子囊菌门某些真菌对HSV-1等病毒有抑制作用，但M. phaseolina分泌代谢物抗HSV-1的潜力尚需评估，这构成本研究开展的理由。

研究内容与意义：研究人员从M. phaseolina培养物中获取粗提物，经色谱纯化、核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）鉴定六种代谢物，并在Vero细胞中评估细胞毒性和抗HSV-1活性，进一步用定量聚合酶链反应（qPCR）、时间加药实验及胞内病毒基因组和信使RNA（mRNA）定量分析作用阶段。结论是多数代谢物抗病毒效果有限，而(?)-botryodiplodin活性最强，表现为半数有效浓度（EC₅₀）2.44 μg/mL、半数细胞毒性浓度（CC₅₀）11.70 μg/mL、选择性指数（SI）4.79，并能抑制HSV-1产生、降低病毒基因组水平、抑制立即早期、早期和晚期病毒基因表达，提示其在病毒转录前发挥早期阶段抑制作用。该发现将天然代谢物确立为新型抗病毒剂合理设计的候选化学骨架，但其宿主细胞毒性和中等选择性指数仍是限制。

关键技术与样本来源（不超过250字）：研究所用菌株M. phaseolina FCQ11分离自巴拉圭San Lorenzo的Universidad Nacional de Asunción实验校区大豆残茬，经翻译延伸因子1α（Tef1-α）测序鉴定，GenBank登录号ON866534。关键方法包括液体培养获取分泌代谢物、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱（HPLC）纯化，采用NMR和HRMS鉴定结构；在Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）中测定细胞毒性和抗HSV-1活性，以qPCR定量病毒基因组；通过时间加药实验及胞内病毒基因组和mRNA的qPCR分析作用阶段和基因表达。

3. Results and Discussion：通过色谱纯化和结构解析，研究人员从M. phaseolina分泌物中分离并鉴定六种代谢物：(?)-botryodiplodin、mellein、hydroxymellein、acetylphomalactone、asperlin和isoasperlin。对于acetylphomalactone，¹H-NMR数据与文献一致，但文献缺乏¹³C-NMR数据，本研究报告并归属其完整¹H-NMR和¹³C-NMR数据；光谱显示α,β-不饱和δ-内酯、C5位乙酰基、C6位连氧碳及反式（E）烯丙基取代，偶合常数与结构相符。asperlin和isoasperlin的光谱数据与文献及X射线晶体学确认的数据一致。通过Vero细胞和qPCR评估，阿昔洛韦在2 μg/mL时抑制>97%，验证实验体系；(?)-botryodiplodin抗病毒活性超过90%，其他代谢物不超过70%。进一步测定(?)-botryodiplodin的CC₅₀为11.70 μg/mL、EC₅₀为2.44 μg/mL、SI为4.79。通过时间加药实验，研究人员观察到(?)-botryodiplodin在预处理和进入后阶段均有显著抗病毒活性，提示可能对细胞和病毒靶点具有双重作用；在感染复数（MOI）10感染后8 h（h.p.i.）检测，(?)-botryodiplodin降低胞内病毒基因组，说明抑制复制。通过mRNA qPCR，研究人员发现其抑制ICP0和ICP4（立即早期基因）、TK（早期基因）以及gB和gC（晚期基因）的表达，其中包括负责早期和晚期基因表达的转录因子ICP4。讨论部分指出，(?)-botryodiplodin曾从Botryodiplodia theobromae、Penicillium roqueforti等分离，并作为PSX-1抗肿瘤化合物报道，也是M. phaseolina的关键植物毒性因子；早期研究提示其具有细胞毒、致突变和基因毒性，主要与抑制宿主DNA合成和DNA–蛋白交联有关，但哺乳动物毒理学资料不足。醛基可诱导DNA–蛋白交联和抗增殖活性，含半缩醛的天然产物可非竞争性抑制逆转录酶，分子对接和动力学模拟提示环状半缩醛可稳定SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）活性口袋的关键相互作用。本研究中(?)-botryodiplodin在Vero细胞呈中等细胞毒性，鉴于早期报告稀少且年代较早，需用现代毒理学和基因毒理学试验强化安全性参数。讨论还指出，病毒复制抑制可能源于干扰复制机器或抑制基因表达；虽然其宿主基因毒性使亚致死细胞应激或宿主DNA机器互作可能间接降低病毒产量，但转录关闭发生在感染周期早期且浓度远低于宿主细胞毒性阈值，因此数据表明其作用为进入后、病毒转录前的靶向抑制，而非宿主细胞破坏后的被动阻断。早期阻断HSV-1感染周期具有治疗吸引力，但中等SI和已知基因毒性限制其原生形式的应用；其独特早期转录关闭能力使其成为化学骨架，未来应开展合理药物化学和结构–活性关系（SAR）研究，将核心抗病毒药效团与宿主细胞毒性解偶联，拓宽治疗窗，并在原代细胞和体内模型中评估合成类似物的安全性和抗病毒效力。

4. Conclusions（研究结论翻译）：在本研究中，研究人员成功从Macrophomina phaseolina中分离并鉴定出六种代谢物，其中(?)-botryodiplodin成为最强效的抗病毒剂。该真菌代谢物似乎通过多种机制发挥作用，包括抑制立即早期病毒基因表达。(?)-botryodiplodin在立即早期转录阶段抑制病毒复制和基因表达的能力，突显其作为抗病毒先导物的潜力。尽管宿主细胞毒性和中等选择性指数是天然产物的明显限制，该化合物仍可作为有价值的化学骨架。未来聚焦结构修饰和SAR优化将是获得更安全、靶向性更强且治疗特性增强的抗病毒衍生物的关键。