基于多组学分析与孟德尔随机化鉴定HEXB作为瘢痕疙瘩放疗候选保护基因及治疗靶点

《Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology》：HEXB as a Candidate Target Gene in Keloid Radiotherapy: Based on Multi-Omics Analysis and Mendelian Randomization

　　

摘要
引言：瘢痕疙瘩（keloid）是整形外科和皮肤科常见且难治的疾病。尽管近年来瘢痕疙瘩放疗受到越来越多关注，但其遗传层面的机制仍研究不足。本研究通过整合多组学与机器学习框架，探讨放射相关基因（radiation-related genes, RRGs）与瘢痕疙瘩的关系，并探索靶向所鉴定关键基因的潜在治疗药物。
方法：整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与多个基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集，以研究RRGs与瘢痕疙瘩的关联。应用多种机器学习算法评估潜在因果关系，随后采用孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析探讨潜在关系。采用空间转录组学（spatial transcriptomics）定位基因在瘢痕疙瘩组织中的表达，并进行虚拟敲除（virtual knockout）分析以评估候选基因在组织结构中的功能作用。最后，进行分子对接（molecular docking）以筛选靶向HEXB的潜在治疗药物，并进行分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟以评估所得蛋白–配体复合物的稳定性。
结果：己糖胺酶β亚基（Hexosaminidase Subunit Beta, HEXB）被鉴定为关键基因。MR分析进一步提供遗传学证据，支持HEXB与瘢痕疙瘩之间潜在的保护性关联，并将HEXB鉴定为候选保护基因。空间转录组学将HEXB定位于纤维化真皮基质，并显示病灶内异质性；虚拟敲除分析提示HEXB参与维持表皮–间充质边界完整性。分子对接显示HEXB可与多种药物预测结合，如他莫昔芬（tamoxifen）和雌莫司汀（estramustine），提示HEXB可能作为这些药物在瘢痕疙瘩治疗中的关键靶点。
结论：本研究通过整合多组学方法鉴定HEXB为瘢痕疙瘩的候选保护基因，并提示HEXB可能作为潜在治疗药物的分子靶点。这些发现为理解瘢痕疙瘩放疗的分子机制和开发靶向治疗策略提供了新方向。

研究背景与目的：瘢痕疙瘩（keloid）是皮肤损伤及持续刺激后的病理性瘢痕组织，以成纤维细胞（fibroblasts）增殖和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积为特征，可导致疼痛、瘙痒及关节活动受限。单纯手术切除后复发率可高达50%，临床指南推荐手术联合放疗为一线治疗，但放疗作用于瘢痕疙瘩的遗传机制仍不清楚。既往研究多集中于DNA修复多态性，放疗相关基因（radiation-related genes, RRGs）作为协调DNA损伤修复、细胞周期检查点和氧化应激反应的整合分子网络，尚未在瘢痕疙瘩发病机制中系统研究。因此，研究人员以RRGs为新视角，整合多组学、机器学习和孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR），旨在识别瘢痕疙瘩放疗相关关键基因并探索靶向治疗药物。

研究人员开展的研究及结论意义：研究人员比较正常成纤维细胞（normal fibroblasts, NFs）与瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts, KFs）中RRGs表达，结合单细胞转录组、共识聚类、双加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和四种机器学习算法，将己糖胺酶β亚基（Hexosaminidase Subunit Beta, HEXB）鉴定为唯一由四种模型共享的关键基因。MR在表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）层面提供HEXB对瘢痕/皮肤纤维化潜在保护关联的遗传学证据，但蛋白数量性状位点（protein quantitative trait loci, pQTL）未支持稳健关联。空间转录组、虚拟敲除、分子对接和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟进一步提示HEXB定位于纤维化真皮基质、参与维持表皮–间充质边界，并可能与他莫昔芬、雌莫司汀及皮质激素类结合。研究意义在于从RRGs角度提出HEXB作为瘢痕疙瘩候选保护基因和潜在治疗靶点，为理解放疗分子机制及开发靶向策略提供新方向，但结论仍属探索性，需实验验证。

关键技术方法：研究人员整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq；HRA000425）、4个GEO纤维母细胞数据集（GSE282479、GSE7890、GSE145725、GSE218007；56例，20例对照/36例瘢痕疙瘩）及RRGs数据集GSE147733（15例，10例照射/5例未照射）；采用共识聚类、双WGCNA、随机森林（random forest, RF）、支持向量机（support vector machine, SVM）、极端梯度提升（eXtreme Gradient Boosting, XGBoost）和广义线性模型（generalized linear model, GLM）；以ukb-b-11403瘢痕/皮肤纤维化GWAS、eQTL（eqtl-a-ENSG00000049860）及deCODE pQTL（35,559人/4,907蛋白）行MR；用GSE307504空间转录组、scTenifoldKnk虚拟敲除、AutoDock分子对接及GROMACS 100 ns MD模拟验证。

研究结果：
1. 瘢痕疙瘩成纤维细胞中RRGs失调：通过批次校正后比较NFs与KFs中973个RRGs，鉴定41个差异表达RRGs（DE-RRGs），并展示其相关网络、染色体分布和差异表达模式；结论为RRGs在KFs中呈协同/拮抗网络失调。
2. 细胞间通讯与功能富集：scRNA-seq获得18个亚群、9类细胞；KFs总体交互强度增加，成纤维细胞为差异通讯网络中心；41个DE-RRGs富集于中期因子（midkine, MK）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）通路，并富集于染色体分离、细胞周期和ECM组织；结论为成纤维细胞通过MK/FGF等信号参与瘢痕疙瘩。
3. 瘢痕疙瘩成纤维细胞中RRG相关亚组：基于41个DE-RRGs将36例KF分为C1/C2，PCA显示分离；基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）显示C2上调染色体分离、细胞周期、DNA复制和修复，下调细胞因子–受体、Notch等；结论为KF存在RRG相关分子异质性。
4. 基因模块筛选与共表达网络：以成纤维细胞含量和C1/C2为性状进行两轮WGCNA，分别得turquoise和brown模块，交集20个簇特异基因；结论为获得与成纤维细胞生物学和放射反应异质性相关的候选基因。
5. 机器学习模型构建与关键基因鉴定：用20个基因构建RF、SVM、XGBoost、GLM；SVM的受试者工作特征曲线下面积（AUC）最高为0.900；HEXB在GLM/SVM最重要、RF第二、XGBoost第三，且为四模型唯一共享基因；DGIdb提示HEXB与可的松、他莫昔芬、雌莫司汀等互作；结论为HEXB为稳健枢纽基因。
6. 孟德尔随机化分析：用ukb-b-11403（1,464例/461,546对照）和HEXB eQTL，单SNP rs820866（β=0.278，SE=0.012，F=552.7），Wald比显示遗传性较高HEXB表达与较低瘢痕/皮肤纤维化风险相关（OR=0.9989，95% CI 0.9981–0.9998，P=0.012/SD），与KFs中下调一致；pQTL 17个SNP，IVW等名义显著但效应近零（OR 1.0001–1.0005），Cochran Q P=0.018，MR-Egger截距P=0.809，不支持蛋白层面稳健关联；结论为eQTL支持HEXB保护关联，但属探索性。
7. HEXB空间定位：GSE307504空间转录组保留8,794个spots，解析7个空间簇；HEXB在切片广泛表达，基线中等，多灶高表达热点，与簇0基质区一致，定位于纤维化真皮基质；结论为HEXB在病灶内异质分布。
8. 虚拟基因扰动：scTenifoldKnk虚拟敲除HEXB，前20个差异调控基因以表皮分化和桥粒/细胞连接基因主，包括PERP、DSC3、TRIM29、DSP、KRT5、DSG1/DSG3、JUP、PKP1、CDH1、TP63等；结论为HEXB调控角质形成细胞/表皮分化和细胞黏附，参与上皮–间充质重塑。
9. 药物–基因互作与分子对接：DGIdb提示HEXB与他莫昔芬、雌莫司汀、奥美拉唑、庆大霉素等互作；五种配体（曲安奈德、地塞米松、倍他米松、他莫昔芬、雌莫司汀）与HEXB最低结合能均低于?5 kcal/mol，雌莫司汀最低（?7.23 kcal/mol）；结论为预测这些药物可与HEXB自发结合。
10. 分子动力学模拟分析：对HEXB–他莫昔芬和HEXB–雌莫司汀复合物及三种皮质激素复合物进行100 ns MD；RMSD、RMSF、Rg、SASA、氢键稳定，MM-PBSA平均结合自由能分别为曲安奈德?24.80、地塞米松?14.18、倍他米松?17.28、他莫昔芬?17.36、雌莫司汀?23.31 kcal/mol，自由能景观以单一低能盆地为主；结论为配体与HEXB形成稳定复合物，但属计算预测。

讨论与结论：作者指出本研究首次系统研究RRGs在KFs中的行为。HEXB编码β-氨基己糖苷酶β亚基，为溶酶体酶；既往研究集中于Sandhoff病，近期伤口修复研究提示HEXB经globotriaosylceramide（Gb3）代谢调控皮肤成纤维细胞，抑制HEXB可促肌成纤维细胞表型，与KFs中HEXB降低一致。MR eQTL支持保护关联，但单SNP限制敏感性分析；pQTL不支持循环蛋白效应，可能因血液与真皮成纤维细胞表达差异、分泌清除及结局非特异。空间转录组提示HEXB在纤维化真皮基质中弥漫表达并有热点，病灶内异质；虚拟敲除提示HEXB维持表皮–间充质边界。分子对接和MD提示三种皮质激素、他莫昔芬和雌莫司汀可与HEXB结合，雌莫司汀结合最强且此前未在瘢痕疙瘩或纤维化疾病探索，但纯属计算预测。局限包括样本量小、无独立外部队列、WGCNA稳定性有限、全依赖公共数据库无实验验证、MR结局非特异且eQTL单工具、pQTL异质性、RRGs来自体外照射成纤维细胞、空间转录组仅单个标本、横断面设计。结论翻译：本研究阐明RRGs与KFs在不同放射反应亚组中的关系。在瘢痕疙瘩成纤维细胞中鉴定枢纽基因HEXB，孟德尔随机化进一步支持HEXB为皮肤瘢痕和纤维化的候选保护因子。虚拟敲除分析进一步提示HEXB参与维持表皮–间充质边界完整性。药物数据库筛选和分子对接鉴定靶向HEXB的候选治疗化合物。本研究为临床医生提供新的研究方向和值得进一步研究的潜在治疗候选物，尽管仍需进一步实验验证。