《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Circulating miRNA-21 and Biomarkers of Inflammation, Fibrosis, and Oxidative Stress in Adults with Type 2 Diabetes Mellitus: A Cross-Sectional Study
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目的： 慢性炎症、氧化应激和纤维化是2型糖尿病（T2DM）并发症相互关联的驱动因素，可能先于常规临床标志物的可检测变化。MicroRNA-21（miR-21）与这三条通路均有关联，但此前很少在单一T2DM人群中同时考察其与代表性生物标志物的关联。研究人员评估了
目的： 慢性炎症、氧化应激和纤维化是2型糖尿病（T2DM）并发症相互关联的驱动因素，可能先于常规临床标志物的可检测变化。MicroRNA-21（miR-21）与这三条通路均有关联，但此前很少在单一T2DM人群中同时考察其与代表性生物标志物的关联。研究人员评估了循环miR-21与血清肿瘤坏死因子受体-1（TNFR1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）之间的相关性，并探讨了不同白蛋白尿状态下的差异。
患者与方法： 本横断面研究是对印度尼西亚茂物非传染性疾病危险因素队列中54例T2DM成人的临床数据和存档血清的二次分析。大多数参与者肾功能保留（平均eGFR为76.9 ± 15.0 mL/min/1.73m2；63.0%无白蛋白尿）。循环miR-21采用定量实时PCR检测；TNFR1、TGF-β1和8-OHdG采用ELISA检测。采用校正年龄、性别、BMI、HbA1c、LDL胆固醇和eGFR的多变量线性回归评估独立关联。进行了Bootstrap重采样和白蛋白尿分层分析。
结果： Log2转换后的miR-21与log2 TNFR1呈弱相关（ρ = 0.273，P = 0.046），校正后仍与TNFR1独立相关（β = 0.061，95% CI 0.001–0.122，P = 0.048）。该临界关联在Bootstrap重采样及额外校正糖尿病病程和他汀类药物使用后仍然稳健。总体上未观察到与TGF-β1或8-OHdG的独立关联。探索性分析显示，在白蛋白尿参与者中miR-21与TGF-β1相关（β = 0.286，P = 0.038），但交互作用不显著（P = 0.087）。
结论： 在肾功能以保留为主的T2DM人群中，循环miR-21与TNFR1（TNF-α相关炎症活性的标志物）相关，但与TGF-β1或8-OHdG无关。这些探索性发现受限于样本量小、统计显著性处于临界水平以及缺乏多重性校正，需要在更大规模的前瞻性多中心研究中加以证实。
论文解读
一、研究背景与问题
2型糖尿病（T2DM）是当今全球最紧迫的公共卫生挑战之一，2021年全球约有5.37亿成人罹患糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7.83亿。T2DM的临床负担主要由其慢性并发症驱动，包括肾脏、心血管及其他终末器官疾病。慢性低度炎症、氧化应激和组织纤维化是糖尿病并发症发生发展过程中密切相关的机制，且这些生物学改变可能先于临床可检测的器官功能障碍出现——在白蛋白尿或估算肾小球滤过率（eGFR）下降等常规标志物变得明显之前，亚临床变化可能已经发生。因此，识别可能连接这些生物学过程的分子调控因子，对于阐明T2DM相关并发症的病理生理机制具有重要意义。
MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，通过结合靶信使RNA（mRNA）上的互补序列在转录后水平调控基因表达。单个miRNA可调控多个靶基因和信号通路，因此可能充当连接不同生物学过程的分子调控因子。其中，microRNA-21（miR-21）在T2DM及其并发症中已被广泛研究，涉及炎症信号、氧化应激和纤维化通路。循环miRNA可从细胞释放入血，在血清和血浆中相对稳定，因此其循环水平被提出可作为组织应激和损伤的可及性读数。
然而，既往研究大多分别考察miR-21与单一生物标志物或通路的关联，机制证据多来自实验模型，临床研究常涉及较小的病例对照人群。在同一T2DM成人群体中同时评估循环miR-21与分别代表炎症、纤维化和氧化应激的生物标志物之间的关系，此前鲜有报道。此外，多数研究聚焦于已确诊的糖尿病肾病，对于肾功能保留或仅有轻度异常、但炎症、纤维化和氧化应激的生物标志物信号可能已经可检测的T2DM成人，相关认识仍然不足。基于此，本研究旨在评估循环miR-21水平与炎症标志物TNFR1、纤维化标志物TGF-β1及氧化应激标志物8-OHdG之间的相关性，并探讨这些相关性是否因白蛋白尿状态而异。
二、研究设计与技术方法
本研究为横断面研究，是对印度尼西亚国家卫生研究与发展研究所（NIHRD）开展的茂物非传染性疾病风险因素队列研究的数据和生物样本的二次分析，利用2021年随访时收集的临床数据、实验室检测结果和存档血清样本。研究对象为2021年随访时确诊为T2DM、年龄≥25岁的成人，排除标准包括数据不完整、妊娠、冠心病史、活动性恶性肿瘤、慢性炎症或自身免疫性疾病、采血前两周内急性感染，以及长期接受全身性抗炎或免疫抑制治疗者。初始55人符合纳入标准，因1人HbA1c数据缺失被排除，最终54人纳入完整病例分析。样本量计算基于既往文献中miRNA-21与TGF-β1的相关系数0.428，α=0.05、80%把握度时最低需41人，计划样本量可检测约0.38及以上的相关系数。
关键技术方法包括：循环miR-21采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）定量，以U6小核RNA（U6 snRNA）为内参，采用2?ΔCt法计算相对表达量；血清TNFR1和TGF-β1分别采用Quantikine? ELISA Human TNF RI/TNFRSF1A免疫分析和DRG? TGF-β1 ELISA检测；血清8-OHdG采用市售夹心ELISA试剂盒检测。统计分析采用Spearman相关分析、多变量线性回归（校正年龄、性别、BMI、HbA1c、LDL胆固醇和eGFR），并进行5000次重采样的偏差校正加速（BCa）Bootstrap区间估计、白蛋白尿分层分析和敏感性分析。
三、研究结果
研究人群特征： 54例T2DM参与者中，平均年龄53.7 ± 8.6岁，59.3%为女性，平均BMI为27.1 ± 3.7 kg/m2，糖尿病病程中位数为8年，18.5%接受他汀治疗。平均LDL胆固醇为129 ± 26 mg/dL，平均eGFR为76.9 ± 15.0 mL/min/1.73 m2，HbA1c中位数为6.45%，尿白蛋白肌酐比（uACR）中位数为19.9 mg/g。miRNA-21相对表达量中位数为6.31，8-OHdG平均浓度为1.50 ± 0.34 ng/mL，TGF-β1和TNFR1中位浓度分别为56,350 pg/mL和1492.5 pg/mL。
相关性分析： 经log2转换后，Spearman相关分析显示miR-21表达与log2 TNFR1浓度呈弱正相关（ρ = 0.273，95% BCa CI 0.006–0.513，P = 0.046）；与log2 TGF-β1（ρ = 0.137，P = 0.323）和8-OHdG（ρ = ?0.052，P = 0.706）无显著相关性。
单变量回归分析： log2转换的miR-21与log2 TNFR1（标准化β = 0.227，P = 0.099）和log2 TGF-β1（标准化β = 0.247，P = 0.072）呈临界正相关，与8-OHdG无关联（标准化β = 0.004，P = 0.976）。
多变量回归分析： 校正年龄、性别、BMI、HbA1c、LDL胆固醇和eGFR后，较高的log2 miR-21表达与较高的log2 TNFR1水平独立相关（调整后β = 0.061，95% CI 0.001–0.122；标准化β = 0.283；P = 0.048）。miR-21与log2 TGF-β1呈正相关但不显著（β = 0.112，P = 0.069），与8-OHdG无独立关联（β = 0.023，P = 0.474）。LDL胆固醇与8-OHdG保持正相关（β = 0.004，P = 0.017）。
敏感性分析： 额外校正糖尿病病程和他汀使用后，miR-21与TNFR1的关联保持显著（β = 0.071，95% CI 0.006–0.136；P = 0.032），与TGF-β1（P = 0.152）和8-OHdG（P = 0.336）仍无独立关联。BCa Bootstrap分析（5000次重采样）结果与主回归模型一致，miR-21与TNFR1的关联仍具统计学意义（β = 0.061，BCa 95% CI 0.004–0.120）。
白蛋白尿分层分析： 白蛋白尿组（n = 20）参与者年龄显著更大（平均差5.6年，P = 0.019），HbA1c显著更高（P < 0.001）。无白蛋白尿组中，miR-21与TNFR1（β = 0.079，P = 0.070）、TGF-β1（β = 0.050，P = 0.538）和8-OHdG（β = ?0.002，P = 0.964）均无独立关联。白蛋白尿组中，较高的log2 miR-21表达与较高的log2 TGF-β1浓度独立相关（β = 0.286，P = 0.038），与TNFR1（β = 0.058，P = 0.260）和8-OHdG（β = 0.067，P = 0.083）无显著关联。交互作用分析显示，白蛋白尿对miR-21与TGF-β1关联的效应修饰接近但未达统计学显著（交互β = 0.091，P = 0.087），对TNFR1（P = 0.749）和8-OHdG（P = 0.389）无显著交互作用。
四、讨论与结论
研究人员指出，miR-21与TNFR1的正相关与既往机制和临床研究一致，支持miR-21参与NF-κB和STAT3介导的炎症信号通路。TNFR1升高反映亚临床肾脏炎症活动，可先于明显白蛋白尿或eGFR下降出现。本研究队列以血糖控制相对良好、肾功能保留和白蛋白尿患病率低为特征，代表尚未进展至晚期糖尿病肾病的群体，miR-21与TNFR1的关联提示炎症变化可能先于结构性肾损伤。然而，调整后效应量适中（标准化β = 0.283），置信区间（0.001至0.122）勉强排除零值，且miR-21本身被描述为"所有疾病的非特异性生物标志物"，该关联可能反映更广泛的低度炎症激活状态（如衰老相关的免疫失调），而非T2DM或肾脏特异性的调控轴。额外校正糖尿病病程和他汀使用后关联反而略有增强（β从0.061增至0.071），不支持他汀相关混杂解释。
总体上未观察到miR-21与TGF-β1或8-OHdG的独立线性关联，这与miR-21具有情境依赖性和疾病分期依赖性作用的观点一致——在早期无并发症的T2DM中可能表现为保护性或静止状态，一旦结构性肾或血管损伤确立则转向促纤维化和促氧化表型。白蛋白尿亚组中miR-21与TGF-β1的显著关联因样本量仅20人、模型估计不稳定且正式交互检验不显著，应视为探索性和假设生成性发现。miR-21与8-OHdG的零关联可能反映标志物生物学和动力学差异——8-OHdG被快速修复和清除，捕捉急性氧化波动，而TNFR1和miR-21更可能作为稳定、累积性标志物；也可能反映氧化应激作为上游触发因素、miR-21主要作为下游炎症程序的一部分被诱导的时序关系。此外，LDL胆固醇是8-OHdG最强的独立相关因素，提示氧化性DNA损伤可能主要由脂质相关氧化通路驱动。
本研究的主要优势包括：分析计划预先设定、Bootstrap重采样和敏感性分析支持结果稳健性、回归诊断未发现模型设定错误、实验室人员对临床特征设盲、批次分析减少变异、同时评估三个生物学域提供整合视角。局限性包括：横断面设计无法推断因果关系；样本量较小，检测TNFR1的ρ=0.273需约104人、TGF-β1的ρ=0.137需约416人，研究对较小关联可能把握度不足；人群以控制良好、肾功能保留为主，外推性受限；存档血清储存约四年且仅一次冻融，存在前分析变异可能；U6 snRNA作为内参可能受高炎症状态影响，但该偏倚方向趋向于将结果推向零假设或负相关，观察到稳健正相关反而提示真实生物学信号较强；三个生物标志物结局未进行多重比较校正，Bonferroni校正阈值0.0167下miR-21与TNFR1的关联（P = 0.048）不再显著；未测量IL-6和TNF-α等上游炎症细胞因子。
研究结论：在肾功能以保留为主的T2DM成人中，较高的循环miR-21表达与较高的TNFR1浓度相关，但与TGF-β1或8-OHdG无关。TNFR1关联未校正时效应适中且统计显著性处于临界水平。20例白蛋白尿参与者中miR-21与TGF-β1的关联属探索性发现，未获显著交互作用支持。这些假设生成性发现提示，在该以肾功能保留为主的人群中，循环miR-21可能与亚临床炎症通路的联系较纤维化或氧化应激更为密切。若在更大规模前瞻性研究中得到证实，循环miR-21联合TNFR1可能有助于在常规标志物异常之前识别有炎症相关肾损伤风险的T2DM患者，但当前数据尚不支持临床应用。
