APN401（自体CBL-B沉默外周血单个核细胞疗法）治疗晚期难治性实体瘤的1期临床评估

《Molecular Therapy Oncology》：Phase 1 evaluation of APN401, an autologous CBL-B-silenced PBMC therapy, in advanced solid tumors

　　

细胞内免疫检查点（intracellular immune checkpoints）调控细胞毒性免疫细胞的活化阈值。Casitas B系淋巴瘤原癌基因B（CBL-B）是一种E3泛素连接酶，负向调控抗原受体信号转导和T细胞活化。APN401是一种自体外周血单个核细胞（PBMC）疗法，采用瞬时小干扰RNA（siRNA）介导的CBL-B沉默。两项1期研究在晚期难治性实体瘤患者中评估了APN401的递增剂量。APN401由白细胞分离术来源的PBMC采用EPiC床旁平台（EPiC point-of-care platform）制备。17例患者接受了三个剂量水平的APN401治疗。APN401显示出良好的安全性特征，未观察到剂量限制性毒性（DLTs）、细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）或≥3级治疗相关不良事件（TRAEs）。制备在不同中心间具有可重复性。尽管未观察到客观缓解，但10例可依据实体瘤疗效评价标准（RECIST）评估的患者中有5例（50.0%）发生疾病稳定，相当于全部17例接受治疗患者的29.4%。探索性分析发现治疗相关的全身免疫变化，包括循环CD8⁺ T细胞富集、细胞毒性介质诱导以及优势T细胞受体β（TCRβ）克隆型扩增。这些变化在疾病稳定患者中最为明显，但仍属探索性且具有假说生成性。上述发现支持在更大规模对照研究中进一步评估APN401。

研究背景：免疫治疗已改变肿瘤治疗格局，免疫检查点抑制剂在多种肿瘤中产生持久获益，但晚期恶性肿瘤患者常因免疫抑制性肿瘤微环境、抗原异质性及肿瘤反应性T细胞进行性功能障碍而不能获得持续缓解；细胞治疗在实体瘤中受限于肿瘤浸润受损、抗原逃逸和制备复杂性。细胞内信号通路调控活化阈值成为免疫调节的新靶点。CBL-B（Casitas B系淋巴瘤原癌基因B）是一种E3泛素连接酶，负向调控抗原受体信号并提高T细胞活化阈值；临床前研究显示抑制CBL-B可增强T细胞活化并促进抗肿瘤免疫，且CBL-B调控包括T细胞和自然杀伤（NK）细胞在内的适应性及固有免疫细胞功能。永久丧失CBL-B功能虽增强免疫细胞活化和抗肿瘤免疫，但实验模型中也与自身免疫易感性增加相关，因此瞬时调控可在避免永久基因破坏的同时增强免疫细胞反应性。APN401为自体PBMC疗法，采用瞬时siRNA介导CBL-B沉默；早期1期评估显示体外CBL-B沉默可行且给药可耐受，为重复给药和快速床旁制备奠定基础。基于此，研究人员开展两项1期研究，在广泛晚期难治性实体瘤人群中评估APN401的安全性、制备可行性和探索性免疫活性。

研究开展与结论意义：两项开放标签多中心1期研究共筛查19例、17例接受至少1次APN401输注并构成汇总安全性人群。患者为异质性晚期难治性实体瘤，均接受过至少2线系统治疗；APN401-104中既往治疗中位4线（范围3–8），6例既往接受过免疫检查点抑制剂。APN401显示良好安全性，未发生DLTs、CRS、ICANS、≥3级TRAEs、治疗相关严重不良事件或治疗相关死亡；制备在不同中心间可重复。虽无客观缓解，但10例RECIST可评估患者中5例（50.0%）疾病稳定，相当于全部17例的29.4%。探索性分析发现治疗相关全身免疫变化，包括循环CD8⁺ T细胞富集、细胞毒性介质诱导和优势TCRβ克隆型扩增，在疾病稳定患者中最明显，但仍属探索性和假说生成性。研究结论支持在更大规模对照研究中进一步评估APN401；其意义在于证明分散式、当日床旁制备和重复给予自体CBL-B沉默PBMC可行，并显示瞬时细胞内检查点调控具有进一步研究价值。

关键技术方法：两项开放标签多中心1期研究APN401-103（EU-CT 2020–002680-55）和APN401-104（EU-CT 2023–504281-34/ClinicalTrials.gov: NCT06172894）纳入晚期难治性实体瘤患者，19例筛查、17例治疗。采集白细胞分离术来源自体PBMC，经EPiC床旁平台电转CBL-B靶向siRNA，制备新鲜非冻存APN401；剂量5×10⁶～4.5×10⁷ PBMCs/kg，3周间隔最多6周期，无淋巴清除或免疫抑制预处理。主要终点为安全性、耐受性、制备可行性及推荐2期剂量（RP2D）；RECIST v.1.1评估最佳总体缓解（BOR）；探索性药效分析含流式表型、可溶性介质、TCR库测序和单细胞转录组；APN401-103采用3+3，APN401-104采用贝叶斯最优区间（BOIN）剂量递增。

研究结果：
APN401制备及拟定作用机制：APN401由自体白细胞分离术来源PBMC经EPiC床旁平台制备，封闭系统纯化后对未分级PBMC电转CBL-B靶向siRNA，去除碎片和残留试剂后配制成药品（DP），输注前放行检测包括外观、身份、数量、纯度、活力和内毒素，静脉到静脉时间<24 h；输注后对保留DP行无菌和功能表征，包括TCR刺激后CBLB mRNA敲低、CBL-B蛋白下调和IL-2诱导。电转后DP活力76.4%±7.2%，CBLB mRNA降低56.0%±14.2%，CBL-B蛋白降低91.4%±10.7%（相对匹配对照）。拟定机制为回输后抗原暴露和TCR活化诱导CBL-B表达，转染siRNA限制活化诱导的CBL-B表达，瞬时降低负向调控并增强T细胞活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒功能。

患者与治疗：17例接受APN401，剂量从5×10⁶至4.5×10⁷ PBMCs/kg，中位完成3周期（1–6）。APN401-103评估剂量1和2；APN401-104评估剂量2和3并在剂量3扩展，剂量3（4.5×10⁷ PBMCs/kg）选为RP2D。停药主要因疾病进展或临床恶化；另有最佳利益退出4例、撤回知情1例、输注前不符合规格（OOS）批次2例。56个制备批次中51个符合输注前放行标准；5个OOS中2个不符合身份、3个不符合数量标准，未修改制备流程但促使缩窄白细胞分离起始物料接受标准。APN401以新鲜、非冻存细胞产品制备和给药，无冻存复苏步骤。

安全性与耐受性：全部17例纳入安全性人群。未发生DLT、CRS、ICANS、≥3级TRAEs、治疗相关严重AEs或治疗相关死亡；多数AE为1–2级，归因于研究操作或基础疾病。TRAEs主要为短暂输注相关症状如乏力、发热、恶心、头晕和头痛；无患者因治疗相关毒性停药。

RP2D确定：三个剂量水平分别3、7、7例；各剂量均无DLT。经BOIN分析和等渗回归校正，各剂量估计毒性概率低于预设25%目标毒性率；基于良好耐受性选择剂量3（4.5×10⁷ PBMCs/kg）为RP2D，在评估剂量范围内未达最大耐受剂量；RP2D选择基于1期剂量递增和安全性评估，不基于临床缓解率。

临床活性：RECIST v.1.1的BOR在10/17例可评估；7例不可评估因早期终止，包括2例OOS批次后、4例最佳利益退出、1例撤回。无客观缓解；10例可评估中5例疾病稳定（SD），疾病控制率（DCR）50.0%，按全部17例为29.4%，其余可评估者为疾病进展（PD）。SD最常在剂量2观察到；各剂量可评估例数少，不能确立剂量-反应关系。大多数停药和死亡归因于疾病进展。一例阑尾癌患者（103-01-005）获延长疾病稳定，治疗开始后4年仍存活；其在延长APN401治疗影像进展后接受后续化疗，因此延长临床过程不能单独归因于APN401。另一例复发/转移性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者（104-02-005）2周期后因临床进展和最佳利益退出停药，但首次输注后约170天随访影像显示靶病灶缩小和先前病灶消退，期间未接受抗癌治疗；因未前瞻性实施iRECIST，该延迟影像发现不能分类为假性进展或明确归因于APN401。

免疫生物标志物分析：探索性免疫生物标志物分析用于描述APN401相关全身免疫变化及SD患者免疫特征；样本量有限，分析为描述性和假说生成性，不用于确立统计学显著性。纵向分析采用基线（C1前）、C1后和C2后配对样本；基线样本在APN401制备前采集，反映未治疗免疫状态。

治疗相关免疫活化：基线至C1后比较显示多种免疫参数早期调节，包括循环CD8⁺ T细胞群、记忆相关T细胞亚群、活化相关标志物和可溶性免疫介质变化。C2后分析显示淋巴和髓系隔室持续免疫重塑，包括CD8⁺ T细胞丰度、CD8⁺/CD4⁺ T细胞比值、B细胞群、单核细胞亚群和髓源性抑制细胞（MDSC）相关参数变化。纵向分析还显示治疗期间抑制性受体PD-1、TIM-3和LAG-3延迟上调。SD患者显示细胞毒性T细胞活化相关标志物纵向变化和全身免疫重塑，包括CD137⁺和TIM-3⁺ CD8⁺ T细胞增加、血浆干扰素-γ（IFN-γ）升高和循环B细胞群扩增；PD与较高单核细胞水平和血浆白介素-10（IL-10）增加相关。这些免疫变化与部分患者优势TCRβ克隆型扩增同时出现；扩增克隆型的抗原特异性未确定。

与临床结局相关的基线免疫特征：基线免疫谱分析探索与临床结局相关的治疗前免疫特征。PD患者基线CD8⁺ T细胞和血浆颗粒酶B（GrB）较高；SD患者基线血浆IFN-γ较高和部分MDSC亚群频率增加。因样本量小和探索性，这些基线差异为描述性和假说生成性。

具有免疫相关性的代表性患者：展示两例延长纵向免疫监测患者的异质性免疫反应动力学。患者103-01-005为转移性阑尾癌，入组前11线治疗，剂量1接受6周期APN401，方案定义治疗期内SD，系列影像靶病灶基本稳定；研究结束后经named-patient use program再接受6周期（共12周期），延长治疗期间影像进展，停APN401并后续化疗后疾病稳定重建，2年和4年生存随访（SuFu）时存活且临床稳定；因后续化疗，不能确定APN401对后续延长临床过程的贡献。其DPs功能表征显示跨批次持续活性：抗CD3/CD28刺激后DPs较匹配非CBL-B沉默对照持续增加白介素-2（IL-2）、CD137、IFN-γ和趋化因子CXCL13分泌（C1–C5），提示CBL-B沉默后T细胞活化可重复增强。纵向免疫监测显示血浆GrB早期增加及IFN-γ和可溶性CD40L（sCD40L）短暂诱导；外周免疫表型显示循环CD8⁺ T细胞早期富集和CD8⁺/CD4⁺比值增加；TCRβ测序显示治疗期间多个优势克隆型扩增，数个持续至2年SuFu；单细胞RNA测序（scRNA-seq）将这些克隆型定位至CD8⁺效应和中央记忆T细胞亚群，但未建立其肿瘤特异性。患者104-02-005为复发/转移性HNSCC，既往3线系统治疗，在RP2D接受2周期后因临床进展和最佳利益退出停药；停药至首次输注后170天随访影像之间未接受抗癌治疗，影像显示靶病灶缩小；血浆分析显示单周期后GrB、sCD40L和IFN-γ明显诱导；外周免疫表型显示循环CD4⁺和CD8⁺ T细胞富集；TCRβ测序显示治疗后优势克隆型扩增，数个克隆自基线增加并在SuFu（筛查后第204天）高度富集，与CD8⁺ T细胞富集同时出现并先于PET-CT延迟靶病灶缩小。因iRECIST未前瞻性实施，该延迟影像不能分类为假性进展或明确归因于APN401；扩增克隆型肿瘤特异性未确定，时间关联不证明因果关系。

讨论总结：讨论指出，免疫治疗仍受免疫抑制微环境、抗原异质性和T细胞功能障碍限制，靶向CBL-B等细胞内检查点可在抗原受体信号下游调节活化阈值。永久CBL-B失活可增强抗肿瘤免疫但实验模型中与自身免疫易感性相关；瞬时调控有望在避免永久基因破坏的同时增强免疫细胞反应性。EPiC平台使分散式、约6小时床旁制备可行，APN401以新鲜非冻存PBMC给药，避免冻存复苏，支持重复给药并可能保留细胞适应性；跨中心可重复性支持其可扩展性。与常伴显著毒性的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和工程T细胞疗法相比，APN401安全性较易管理，但跨试验比较有限。未分级PBMC保留T细胞以外免疫细胞，CBL-B也负向调控NK、B和髓系细胞活化，但本研究未专门评估这些非T细胞群的功能贡献；APN401不特异富集肿瘤反应性淋巴细胞，输注细胞运输和组织分布未评估，不能排除非肿瘤反应性细胞群削弱肿瘤定向活性。虽无客观缓解，SD 5/10（50.0%）即全部17例的29.4%，5例SD中3例既往接受过免疫检查点抑制剂；无客观缓解的具体机制不能归因，尤其瞬时siRNA介导CBL-B沉默和修饰细胞持久性因未直接量化动力学而不能评估。SD患者仍显示全身免疫调节。患者104-02-005延迟影像发现意义不确定，因iRECIST未前瞻性实施。治疗相关免疫变化符合全身免疫调节；抑制性受体PD-1、TIM-3、LAG-3纵向增加可能反映免疫活化后的生理反馈，但不能排除功能未验证的失调或耗竭T细胞状态。基线PD患者CD8⁺ T细胞和GrB较高、SD患者IFN-γ和部分MDSC较高，不应解释为预测性生物标志物。研究局限性包括1期设计固有样本量小、肿瘤组织学异质、反应可评估患者有限、探索性生物标志物分析未按统计推断设计；无客观缓解限制临床活性结论；延迟影像难以解释；CBL-B沉默持续时间和修饰细胞持久性无法直接确定；研究无接受同样处理但无CBL-B靶向siRNA的自体PBMC体内对照，不能排除白细胞分离、电转和PBMC回输对全身免疫变化的贡献。未来研究应确定观察到的免疫调节是否转化为有意义的临床获益，以及基线免疫特征能否指导患者选择；探索性发现为重复给药和与免疫检查点抑制剂联合提供依据，其改善临床活性的潜力尚待确立；药理靶向CBL-B也在探索中。

结论翻译：总之，这些1期研究表明，分散式、当日床旁制备和自体CBL-B沉默PBMC重复给药具有可行性，并伴随良好安全性特征；治疗期间观察到的探索性免疫变化为在更大规模对照研究中进一步研究瞬时细胞内检查点调控提供了生物学依据。