LC–HRMS、网络药理学与分子对接整合揭示Capsicum annuum乙醇提取物经氧化应激、炎症及生存通路抑制肺腺癌并获DEN诱导模型验证

《Current Research in Biotechnology》：Capsicum annuum suppresses lung adenocarcinoma through oxidative, inflammatory, and survival pathway modulation

　　

• 液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）在Capsicum annuum提取物中鉴定出30种生物活性化合物，包括辣椒素类（capsaicinoids）、黄酮类（flavonoids）、类胡萝卜素（carotenoids）和酚酸类（phenolic acids）。
• 网络药理学（network pharmacology）识别出Capsicum annuum化合物与肺腺癌相关基因之间的503个共享靶点。
• 分子对接（molecular docking）显示其与关键致癌蛋白AKT1、EGFR、SRC、STAT3、TNF和HIF1A具有强相互作用。
• 该提取物抑制氧化应激和炎症信号，同时增强抗氧化防御机制。
• 体内治疗降低二乙基亚硝胺（DEN）诱导肺腺癌中的肿瘤生物标志物和增殖标志物，同时促进凋亡。

研究背景与问题：肺癌仍是全球最常见恶性肿瘤和癌症相关死亡首要原因，腺癌为男女中最常见组织学亚型，且与非吸烟者及年轻患者关系密切，提示环境和饮食因素参与其发病。现有靶向治疗、免疫治疗及铂类化疗、紫杉类、酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点阻断仍受获得性耐药、全身毒性及资源可及性限制，早期检测和治疗监测生物标志物亦有限，因此需要多靶点治疗和化学预防策略。植物化学物具有多靶点、低毒性和抗癌药物发现基础，Capsicum annuum L.（辣椒，Solanaceae）含辣椒素类、类胡萝卜素、黄酮类、酚酸类和维生素，具有抗氧化、抗炎和抗癌特性；辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类80–90%，被视为主要活性驱动因素。已有证据多涉及分离的辣椒素，而保留完整植物化学基质并具潜在协同作用的粗C. annuum提取物在生物学相关体内肺癌模型中的研究仍少。网络药理学可映射多成分与多疾病靶点，适合粗提物多药理学。为此，研究人员采用LC–HRMS成分谱、网络药理学和分子对接预测，再以A549细胞体外细胞毒、氧化还原和炎症实验及DEN诱导肺腺癌大鼠模型验证，系统评价C. annuum乙醇提取物（ChE）抗肺腺癌潜力，意在为辣椒来源植物化学物作为肺腺癌辅助或预防制剂提供依据。DEN为经CYP2E1生物活化后形成DNA加合物、诱导Kras突变并驱动与人肺腺癌组织病理学一致恶性转化的N-亚硝基致癌物，适合评估肿瘤标志物、氧化应激、炎症及增殖和凋亡信号。

关键技术方法（不超过250字）：样本来源为印度尼西亚北苏门答腊新鲜C. annuum果实，经鉴定并存凭证标本No. 762/MEDA/2025，制备ChE。关键技术包括高效液相色谱–光电二极管阵列检测（HPLC-PDA）标准化辣椒素、二氢辣椒素、槲皮素和阿魏酸；LC–HRMS进行成分谱分析；SwissTargetPrediction、GeneCards、STRING、Cytoscape和ShinyGO开展网络药理学与通路富集；CB-Dock2进行分子对接；DPPH、ABTS和FRAP评价体外抗氧化；A549和MRC-5细胞进行MTT细胞活力、DCFH-DA活性氧（ROS）及ELISA生物标志物检测；25只雄性Wistar大鼠行DEN诱导肺腺癌模型，设正常、DEN阴性、多西他赛阳性及ChE100和ChE200组，检测血清生化指标和肺组织Ki-67、caspase-3、NF-κB p65免疫组织化学（IHC）。

研究结果：3.1 基于LC–HRMS的植物化学成分分析：LC–HRMS暂定鉴定30种化合物，归属辣椒素类/辣椒酸酯类、酚酸类、黄酮类、类胡萝卜素和有机酸，均以[M + H]⁺正离子模式检测，质量误差?2.97至+2.80 ppm；HPLC-PDA以保留时间和紫外光谱确认4种标志物；辣椒素类中 homocapsaicin 峰面积最大，酚酸类中阿魏酸峰面积最大，黄酮类包括芹菜素、柚皮素、槲皮素、芦丁、山柰酚、木犀草素和杨梅素，类胡萝卜素中 capsorubin 最丰富，另检测抗坏血酸。3.2 网络药理学与通路富集分析：通过共享靶点分析获得503个ChE成分与肺癌相关基因交集靶点，KEGG富集集中于EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、PI3K–Akt、HIF-1及癌症通路，PPI识别AKT1、SRC、TNF、EGFR、IL6、CTNNB1、STAT3、HIF1A、ESR1和HSP90AA1为高度连接枢纽基因。3.3 分子对接分析：对25种成分与10个枢纽蛋白对接，芦丁总体结合最强，对SRC（?12.3 kcal/mol）、AKT1（?11.2 kcal/mol）和EGFR（?10.6 kcal/mol）突出；β-胡萝卜素对EGFR（?11.7 kcal/mol）、玉米黄质对EGFR（?11.2 kcal/mol）和ESR1（?9.2 kcal/mol）、capsorubin对AKT1（?10.8 kcal/mol）和SRC（?10.2 kcal/mol）、鞣花酸对HSP90AA1（?9.1 kcal/mol）、capsorubin对HIF1A（?8.8 kcal/mol）结合较强；黄酮类呈广谱多靶点结合，抗坏血酸和简单酚酸较弱。3.4 体外研究：3.4.1 细胞毒活性：MTT显示ChE以浓度和时间依赖方式降低A549活力，IC₅₀由24 h的148.6 ± 6.4 μg/mL降至48 h的86.3 ± 4.9 μg/mL，MRC-5的IC₅₀较高，选择性指数（SI）为2.26和2.75，提示选择性有限。3.5 细胞内ROS：DCFH-DA显示ChE使A549细胞内ROS呈浓度依赖升高，25、50、100和200 μg/mL时分别为对照的128.4 ± 6.2%、156.7 ± 7.9%、201.3 ± 9.6%和268.5 ± 11.4%，≥50 μg/mL显著，提示ROS过量参与细胞毒。3.6 A549细胞氧化应激和炎症生物标志物ELISA：ChE使SOD、GSH、CAT和GPx升高，使TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2和VEGF降低，较高浓度MDA升高，提示抗氧化适应不足抵消ChE诱导的氧化负荷。3.7 DPPH、ABTS和FRAP体外抗氧化活性：乙醇提取物DPPH最大抑制34.1%（80 μg/mL）最高，甲醇提取物ABTS最大抑制35.7%（10 μg/mL）最高，FRAP甲醇提取物平均50.26 μM FeSO₄最高，乙醇和甲醇提取物单位质量还原活性相近（3.11和3.08 μM/mg），ChE因DPPH活性和质量归一化还原能力最高被选用。3.8 生化参数：DEN诱导大鼠CEA、NSE、MDA、IL-6和TNF-α升高，SOD和GSH降低；ChE剂量依赖逆转，ChE200最强并使指标接近多西他赛阳性对照，CEA降53%、NSE降37%、SOD升52%、GSH升107%、MDA降48%、IL-6降55%、TNF-α降52%。3.9 Ki-67免疫组化：正常组Ki-67稀疏，DEN组明显增加，多西他赛降低，ChE100中度降低、ChE200更明显且肺泡结构较好，提示剂量相关抗增殖，但为代表性切片定性评估。3.10 caspase-3免疫组化：正常肺caspase-3少，DEN组弱，多西他赛增加，ChE亦增加且ChE200更强、分布更均匀并伴肺泡形态改善，提示恢复凋亡信号。3.11 NF-κB免疫组化：正常组NF-κB极少，DEN组弥漫强阳性，多西他赛降低，ChE100中度降低、ChE200更明显且肺泡结构较好，提示抑制DEN诱导肺癌相关炎症信号。

讨论总结与结论翻译：讨论指出，LC–HRMS谱与已发表C. annuum特征一致，阿魏酸、capsorubin和辣椒素类分别有抗癌、抑制A549生长及凋亡诱导相关证据；但栽培品种未表征，辣椒素类含量受基因型、成熟度和栽培条件影响，本提取物中homocapsaicin等峰面积大于辣椒素，且正离子ESI离子化行为不同，故活性不能归因于辣椒素单一成分，标准化植物来源和品种很重要。网络药理学将EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗列为最富集通路，并涉及PI3K–Akt、MAPK、HIF-1和Ras信号，通路映射覆盖受体旁路、JAK–STAT3、PI3K–AKT–mTOR和MAPK/ERK；对接提示芦丁、槲皮素、β-胡萝卜素、玉米黄质、capsorubin和鞣花酸等与枢纽蛋白结合，但对接分数仅预测亲和力，不能证明细胞内靶点抑制，STAT3和HIF-1α预测尤需实验确认。DPPH、ABTS和FRAP显示ChE具中等自由基清除和铁还原活性；A549中ROS和MDA升高而DEN大鼠血清MDA降低、SOD和GSH恢复，原文以暴露差异、靶细胞氧化还原状态差异和检测 compartment 差异解释为互补效应：酚类低浓度抗氧化、高浓度促氧化，癌细胞基础ROS高更易超过凋亡阈值，体内血清反映全身体氧化应激并由类胡萝卜素、抗坏血酸直接清除及黄酮经Nrf2–ARE诱导抗氧化酶而缓解。DEN模型CEA和NSE升高且ChE剂量依赖降低，提示肿瘤活性下降；IL-6和TNF-α降低与枢纽基因预测及芦丁对接一致，IL-6为STAT3上游激活因子、TNF-α激活NF-κB，故细胞因子和NF-κB染色降低与STAT3信号减弱相容但不能证明。局限性包括网络预测与生物效应联系间接、未测p-STAT3/STAT3和HIF-1α及p-AKT和p-EGFR、MTT无参考化疗药、SI仅2.26–2.75且未在正常细胞测ROS和死亡方式、体内仅终点测量且DEN多灶肺内病变无法卡尺或micro-CT纵向监测、IHC为定性无数字定量且无H&E病理评分、未报告HPLC-PDA标志物绝对浓度、LC–HRMS为正离子半定量且品种未表征、n=5较小且仅雄性大鼠和短疗程。临床和药学意义在于C. annuum为廉价且广泛食用、具安全性记录的食物，口服ChE在肺癌发生模型中产生接近多西他赛的剂量依赖获益，支持其作为标准化化学预防营养品或化疗辅助剂开发，尤其适用于靶向治疗可及性有限地区；标志物可用于质量控制，辣椒素类和类胡萝卜素水溶性差及辛辣性提示纳米包封等制剂策略，临床转化前需药代动力学、重复给药毒性和与标准化疗联合评价。研究结论翻译：本研究表明，C. annuum乙醇提取物（ChE）具有抗肺腺癌活性，并得到整合计算、体外和体内证据支持。LC–HRMS鉴定30种成分，主要为辣椒素类、酚酸类、黄酮类和类胡萝卜素；网络药理学和对接预测其作用于关键致癌和炎症枢纽。ChE降低A549活力，对正常成纤维细胞选择性有限，并增加癌细胞内ROS。在DEN诱导大鼠中，ChE剂量依赖性降低肿瘤标志物、氧化应激和促炎细胞因子，恢复抗氧化防御，减少Ki-67和NF-κB染色并增加caspase-3染色。这些效应反映情境依赖性氧化还原活性，即在转化细胞中促氧化、在系统水平抗氧化，并伴随炎症、增殖和凋亡通路调节。仍须验证预测的STAT3和HIF-1α靶点，开展定量组织病理学、标志物定量、药代动力学评价和长期毒性研究，以支持ChE作为肺腺癌植物药物候选物的开发。