百日咳博德特氏菌的基因组动态与大环内酯类抗生素耐药性：对监测及快速可视化检测的启示

《Drug Resistance Updates》：Genomic dynamics and macrolide resistance in Bordetella pertussis: implications for surveillance and rapid visual detection

　　摘要

背景
COVID-19大流行后百日咳的重新出现引发了对百日咳杆菌（Bordetella pertussis）群体变化和 macrolide 耐药性增加的担忧。本研究旨在描述中国及全球范围内百日咳杆菌的群体动态及其具有临床意义的基因组变化，并开发一种用于检测 macrolide 耐药性相关 23S rRNA A2047G 突变的快速可视化检测方法。

方法
在这项横断面基因组流行病学研究中，对 22 个近期临床分离株进行了测序和分析，并与 7,322 个公开可用的百日咳杆菌基因组进行了比对。利用 7,344 个基因组评估了全球群体结构，并对 1951-2024 年期间收集的 1,292 个分离株中选出的 1,054 个具有时间信息的 Chinese 基因组进行了贝叶斯系统发育分析。我们设计并优化了一种等温环介导扩增（LAMP）检测方法，该方法包含 3’-末端的人工错配序列和中性红指示剂，用于检测 macrolide 耐药性相关的 23S rRNA A2047G 突变。通过使用系列稀释的质粒和 39 个人工合成的 DNA 样本，对该方法的分析灵敏度和特异性与定量 PCR (qPCR) 进行了评估。

结果
2024 年，根据 23S rRNA A2047G 突变定义的中国百日咳杆菌的 macrolide 耐药性达到了 98.9%（88/89；95% CI 93.9-100），同时 ptxP3-MT28 亚谱系也迅速克隆扩增。在可用的 Chinese 分离株中，预测的 Prn 缺陷株比例上升到 31.46%，其中 12 种不同的 prn 失活机制主要由 IS481 介导的插入引起。优化的 LAMP 方法在 65°C 下 50 分钟内区分了突变型和野生型等位基因，其中性红可视化检测限 (LOD) 为 10 个拷贝/μL，而 qPCR 的检测限为 100 个拷贝/μL。LAMP 方法的结果与所有 39 个人工合成样本的 qPCR 结果一致。

结论
百日咳杆菌群体经历了明显的基因组变化，表现为抗原变异和 macrolide 耐药性，尽管这些时间和基因组模式的进化驱动力仍有待确定。可视化的 LAMP 方法提供了快速区分 A2047G 等位基因的概念验证分析证据，并且在经过前瞻性临床呼吸道样本验证后可能具有未来的即时检测潜力。这些发现支持继续进行基因组监测和进一步评估疫苗抗原匹配及抗菌药物耐药性。

引言
百日咳，又称哮吼，是一种由革兰氏阴性细菌百日咳杆菌引起的高度传染性的呼吸道疾病。虽然成人百日咳通常表现为轻微症状，但它与婴儿的高死亡率相关。临床诊断主要依赖于特征性症状，包括持续超过 2 周的阵发性咳嗽、吸气性喘息和咳嗽后呕吐（中华人民共和国国家卫生健康委员会，2007 年；世界卫生组织，2018 年；疾病控制与预防中心，2022 年；欧洲疾病预防控制中心，2011 年）。在婴儿中，还可能观察到其他并发症，如抽搐、呼吸暂停和淋巴细胞增多（Mikelova 等，2003 年）。在 20 世纪 30 年代引入疫苗之前，百日咳是美国婴儿中最常见和最严重的疾病之一（Todar）。经过 20 世纪 50 年代的广泛疫苗接种运动后，百日咳在发达国家变得罕见。然而，在没有常规疫苗接种计划的地区，它仍然是一个重大威胁，估计每年全球有 5,100 万例病例和 600,000 例死亡（Todar）。值得注意的是，即使在已接种疫苗的人群中，无症状或轻度感染也可能促进向未接种疫苗或部分接种疫苗的婴儿的传播（欧洲疾病预防控制中心，2010 年）。
20 世纪 40 年代中期，全细胞百日咳疫苗（WCVs）作为常规免疫的一部分在全球范围内被采用，最初降低了疾病发病率（Mattoo 和 Cherry，2005 年）。然而，关于 WCVs 的严重不良反应的报告导致疫苗接种率下降，进而在一些地区百日咳再次流行（Miller 等，1982 年）。这促使了安全性更好的无细胞百日咳疫苗（ACVs）的开发。1981 年，日本率先引入了 DTaP 疫苗（白喉-破伤风-无细胞百日咳），大多数发达国家在 20 世纪 90 年代中期也采用了这种疫苗（Noble 等，1987 年；Klein，2014 年）。尽管 ACVs 的反应原性较低，但其效力不如 WCVs 或自然感染持久（Burdin 等，2017 年；Lavine 等，2012 年），这可能是近期百日咳重新流行的原因之一。ACVs 通常包含 1-5 种细菌抗原，包括丝状血凝素（FHA）、百日咳毒素（Prn）和菌毛蛋白 Fim2 和 Fim3（Fu 等，2023 年）。值得注意的是，只有五价 ACVs（包含所有五种抗原）表现出与 WCVs 相媲美的效力（Burdin 等，2017 年）。此外，ACVs 在清除鼻咽部的百日咳杆菌定植方面可能效果较差，导致接种者可能成为无症状携带者（Burdin 等，2017 年）。
尽管疫苗接种覆盖率很高，但在许多国家百日咳的发病率仍然周期性复发（每 2-5 年一次）（Todar）。提出的解释包括诊断意识的提高、免疫力下降、病原体适应（Mooi 等，2014 年）以及疫苗株与流行分离株之间的抗原差异（Mooi 等，2009 年；Cassiday 等，2000 年；Elomaa 等，2005 年）。在报道的抗原丢失表型中，Prn 缺陷是全球最常见的抗原缺失表型，而 Ptx 和 FHA 缺陷株较为罕见，仅被零星报告（Lefrancq 等，2022 年）。例如，在法国、日本和荷兰引入 ACVs 后，出现了缺乏 FHA、Ptx 或 Prn 表达的菌株（Mooi 等，2014 年；Otsuka 等，2012 年；Bouchez 等，2011 年；Barkoff 等，2012 年）。此外，虽然历史上 ptxP1 等位基因在百日咳杆菌群体中占主导地位（Octavia 等，2011 年），但自 2000 年代以来，欧洲和美洲的主要谱系已由 ptxP3 等位基因取代（Mooi 等，2009 年；Kallonen 等，2012 年）。
与全球趋势不同，根据现有的基因组监测数据，直到最近几年 ptxP3 等位基因在中国仍占主导地位（Xu 等，2019 年）。这一差异突显了对中国百日咳杆菌的时间和基因组特征进行深入分析的必要性。一个合理的假设是，中国的 WCVs 替代发生在美国和澳大利亚等发达国家之后十年（Liu 等，2018 年）。因此，ptxP3 等位基因可能没有足够的时间在中国取代 ptxP1 等位基因成为主要谱系。随后，通过从 macrolide 敏感分离株的突变产生了 macrolide 耐药的 ptxP1 等位基因，最终成为中国的主要流行克隆（Xu 等，2019 年）。与此观察一致的是，来自不同地区的 macrolide 耐药分离株显示出不同的遗传背景。虽然来自美国和法国的有限 macrolide 耐药分离株与 ptxP3/fim3-2 支系相关，但中国的耐药分离株主要属于 ptxP1/fhaB3 谱系，表明 macrolide 耐药性发展的遗传轨迹存在地区差异（Bridel 等，2022 年）。值得注意的是，一种新的 macrolide 耐药 ptxP3 克隆（MT28-Shanghai）最近在中国上海扩散。ptxP3 分离株的比例从 2018 年的 35% 上升到 2022 年的 100%（Cai 等，2023 年），需要继续评估其在中国中的流行病学和抗原意义。随后，在美国、法国和日本也发现了密切相关的 MT28-ptxP3-MRBP 等位基因，表明这种克隆具有更广泛的地理分布（Xu 等，2025 年）。
早期诊断和及时治疗对于控制百日咳的传播至关重要（Ernst，2022 年）。Macrolides 仍是百日咳临床治疗的基石；然而，抗菌药物耐药性使治疗变得复杂，增加了治疗成本，延长了治疗时间，并降低了治疗效果。在分子水平上，百日咳杆菌的 macrolide 耐药性主要由 23S rRNA 基因第 V 域的肽转移酶中心的点突变介导，其中 A2047G 突变（与大肠杆菌的 A2058G 相同）是最常报告且具有临床意义的机制。这种突变降低了 macrolides 与核糖体靶标的结合亲和力，从而赋予了对红霉素及相关抗生素的高水平耐药性（Bartkus 等，2003 年）。与许多其他革兰氏阴性细菌不同，百日咳杆菌中很少检测到 erm 或 mef 等获得的耐药基因，这突显了染色体点突变在 macrolide 耐药性发展中的核心作用。到目前为止，已经建立了几种实验室开发的聚合酶链反应（PCR）和实时定量 PCR (qPCR) 方法来专门检测 A2047G 突变（Wang 等，2015 年；Zhang 等，2013 年；Kamachi 等，2020 年）。尽管有用于快速定性检测百日咳的商业诊断试剂，但它们无法及时识别抗菌药物耐药性。目前，表型抗菌药物敏感性测试 (AST) 仍然是临床实践中抗生素耐药性检测的金标准。然而，百日咳杆菌难以分离和培养，且培养周期较长。因此，迫切需要一种快速、经济高效且用户友好的方法来检测百日咳杆菌的 macrolide 耐药性。等温环介导扩增（LAMP）能够在等温条件下实现快速和特异的核酸扩增，最新的进展使得该方法能够准确检测单核苷酸多态性（SNPs）（Hao 等，2024 年；Ckumdee 等，2025 年）。
基于公开可用的百日咳杆菌序列的先前大规模基因组监测研究提供了关于全球群体结构、进化历史和流行谱系传播模式的重要见解（Xu 等，2019 年；Xu 等，2025 年）。其中两项最新的分析基于大部分重叠的公共基因组数据集，描述了大流行后的 macrolide 耐药谱系的扩张和全球范围内的出现。然而，这些研究主要集中在系统发育关系和群体动态上，而新兴基因组适应的临床意义，包括抗原丢失变异和耐药相关突变，尚未得到充分探索。此外，将基因组监测结果与快速分子诊断方法相结合以检测抗菌药物耐药性尚未得到很好的建立。
与全球趋势类似，中国自 2024 年以来也经历了百日咳的爆发（Xu 等，2025 年）。本研究旨在描述中国百日咳杆菌群体的群体动态及其具有临床意义的基因组变化。为此，我们在 2024 年 2 月至 7 月期间从中国的一家三级医院收集了经过培养确认的百日咳杆菌分离株，进行了横断面基因组流行病学研究。通过整合表型和临床数据以及与中国和全球分离株的比较基因组分析，我们描述了中国的百日咳杆菌群体结构和进化动态，并调查了流行谱系的近期传播情况。除了基因组流行病学分析外，我们还建立了一种可视化 LAMP 检测方法，用于快速检测 macrolide 耐药的百日咳杆菌，该方法特异性针对 23S rRNA 基因中的 A2047G 点突变，使用中性红作为显色剂，使结果可以直接用肉眼读取。我们优化了反应条件，并评估了该方法的分析灵敏度和特异性，包括中性红的可视化检测限 (LOD)，以及在受控条件下与 qPCR 的一致性。本研究将基因组监测与具有未来即时检测潜力的概念验证可视化方法联系起来。

章节片段
**菌株收集、全基因组测序和测序数据组装**
根据临床表现和当前的百日咳诊断标准，共收集了 1,428 份鼻咽拭子样本（图 1，表 S1），随后进行了针对 Bordetella 物种特定 IS481 序列的常规实时 PCR 筛查。PCR 阳性的样本接种在百日咳杆菌木炭培养基（Saimike Biotechnology Co., Ltd.）上，并在 35℃ 的 CO2 恒温培养箱中培养 7 天。在后COVID-19大流行时代，该研究得到了以下机构的支持：国家自然科学基金委员会（82472335）、国家重点研发计划（2023YFC3603104和2025YFE0205800）、浙江省自然科学基金（LR23H200001）、浙江省“先锋”和“领头鹅”研发计划（2024C03217和2026C02A1132）、浙江省疾病预防与控制科技计划（2025JK139），以及香港赛马会基金会。研究者名单如下：Jo?o Pedro Rueda Furlan（负责撰写、审稿与编辑、数据采集）；Shuangshuang Li（负责撰写、审稿与编辑、软件开发、数据管理）；Patrick Butaye（负责撰写、审稿与编辑、数据采集）；Yilu Zhuang（负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件开发、方法论设计、数据分析）；Yingying Zhang（负责撰写、审稿与编辑、数据分析）；Xiaoyang Jin（负责撰写、审稿与编辑、数据分析、形式分析）；Fang He（负责撰写）。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能会影响本文的研究结果。

**作者名单**
Yilu Zhuang | Shuangshuang Li | Danni Bao | Xiaoyang Jin | Fangbin Xiao | Qing He | Huiqiong Jia | Fang Shen | Tian Jiang | Xinyou Xie | Jun Zhang | Patrick Butaye | Jo?o Pedro Rueda Furlan | Fang He | Yingying Zhang | Xingyu Lin | Zhi Ruan