高粱植物蓝素基因的生物信息学特征分析与时空表达谱分析

《Ecological Genetics and Genomics》：In silico characterization and spatiotemporal expression profiling of phytocyanin genes in sorghum

　　

植物蓝铜蛋白家族在种子萌发、花药发育、花粉管化学趋向性以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥电子运输作用，其功能已得到充分证实。然而，该家族尚未在主要谷物作物高粱中得到系统表征。我们进行了全面的生物信息学分析，在高粱中鉴定出65个植物蓝铜蛋白编码基因（SbPCs）。根据结构域结构、铜配体残基和糖基化位点的存在情况，将SbPCs进一步分为四个亚家族，即早节点素样蛋白（SbENODLs）、星蓝铜蛋白（SbSCLs）、植物蓝铜蛋白（SbPLCs）和UCL蓝铜蛋白（SbUCLs）。结构预测表明，大多数SbPCs为糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，而其中一些也是杂合阿拉伯半乳聚糖蛋白。重复分析表明，串联重复和片段重复共同驱动了SbPC家族的扩展，尤其在SbENODL和SbUCL亚家族中最为显著。与拟南芥和稻进行比较系统发育分析，揭示了双子叶植物和单子叶植物特有谱系之间明显的进化分歧，高粱SbPCs与稻的同源基因关系更为密切。表达谱分析结合系统发育背景和同源基因的功能证据表明，SbPLCs表现为根和种子偏好性表达，且可能受miR408调控；而SbENODLs在花药、种子和根组织中表现出优势表达。另一方面，SbUCLs在花前干旱恢复期间在根部优先激活，而SbSCLs表现出多样化的表达模式。启动子分析鉴定出顺式作用元件，与观察到的时空表达模式一致。总体而言，本研究提供了高粱植物蓝铜蛋白家族的全方位概述，对未来功能基因组学和作物改良研究具有重要意义。

铜（Cu）是植物必需微量营养元素之一。它作为多种酶的辅因子[1]。许多重要的生理过程，如光合作用、呼吸作用、蛋白质运输和信号转导，也需要铜[2]。多种蛋白质结合铜并发挥重要的生物学功能。其中一类为植物特有的I型蓝铜蛋白（BCPs），即植物蓝铜蛋白（PCs）[3]。它们作为电子运输蛋白，在植物生长和存活中发挥重要作用[4]。所有PCs中均存在类质体蓝素结构域（PLCD）[5]，大多数PCs含有两个保守的半胱氨酸残基，形成分子内二硫键[6]。大多数PCs除PLCD结构域外，在N端还具有信号肽（SP），将蛋白靶向至分泌途径。部分PCs含有第三个结构域——阿拉伯半乳聚糖蛋白样区（ALR），使蛋白整合入植物细胞壁。在C端存在的第四个结构域——糖基磷脂酰肌醇锚定位点信号（GAS），可使蛋白锚定于细胞膜[4,7]。

根据结构域结构、铜配体残基和糖基化位点，PCs被进一步分为四个亚家族，分别为早节点素样蛋白（ENODLs）、星蓝铜蛋白（SCLs）、植物蓝铜蛋白（PLCs）和UCL蓝铜蛋白（UCLs）[8]。ENODLs具有PLCD结构域，但缺乏经典的I型铜结合残基，因此不与铜结合[9]。SCLs、PLCs和UCLs均具有全部四个保守的铜结合残基，包括两个组氨酸（His）、一个半胱氨酸（Cys）以及第四个轴向铜结合配体，该配体因亚家族而异：SCLs含有谷氨酰胺（Gln），而PLCs和UCLs含有甲硫氨酸（Met）。尽管PLCs和UCLs共享相同的四个保守铜配体，但与UCLs不同，PLCs的骨架上缺乏潜在的糖基化位点[10,11]。UCLs和ENODLs在植物基因组中经历了最大程度的扩展[4,7]。稻含有35个OsUCLs、3个OsSCLs和24个OsENODLs，而拟南芥含有9个AtUCLs、5个AtSCLs、27个AtENODLs和单个AtPLC基因[4,5]。PCs在调节植物生长和发育以及环境胁迫响应中发挥重要作用。前期在模式植物中的研究表明，PCs在花粉管化学趋向性、种子萌发、花药形成、类黄酮代谢、筛管发育以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥关键作用[[12], [13], [14], [15], [16]]。

ENODL蛋白的命名源于其与豆科植物中鉴定的早节点素（ENOD）基因的序列同源性；然而，其在拟南芥和单子叶植物中的存在提示其功能超越结瘤[17,18]。例如，拟南芥ENOD样蛋白（SE-ENOD）在筛管元素中表达，已被证明可调节光合产物分配和碳水化合物信号，从而影响开花时间和整体生殖发育。其功能缺失导致抽薹延迟和角果数量及生物量降低，与突变体相比，野生型植物的角果数量几乎增加两倍，生物量增加三倍[19]。Zhang及其团队证明GhENODL6通过诱导水杨酸信号通路并调节活性氧（ROS）的产生，在棉枯萎病抗性中发挥关键作用[20]。类似地，Ntui和同事证明了ENODL3在香蕉抗病中的功能[18]。

星蓝铜蛋白（SCLs）也参与多种植物生长和胁迫响应过程。其中，AtSC3，又称"蓝铜结合蛋白"（BCB），是研究最广泛的星蓝铜蛋白。研究表明它在酵母中赋予铝耐受性，并增强拟南芥对铝和酰胺的耐受性。此外，AtSC3过表达与拟南芥中木质素积累增加相关[21]。类似地，PtSC18过表达增强了转基因拟南芥的抗旱性[22]。尽管有这些发现，大多数星蓝铜蛋白基因仍未得到充分表征，凸显了进一步功能研究的必要性。

另一方面，植物蓝铜蛋白（PLCs）主要参与生殖器官发育[23]。PLANTACYANIN（PCY）是一种液泡相关蓝铜蛋白，作为拟南芥种子萌发的负调控因子发挥作用。它在成熟种子中高度表达，并在萌发过程中快速下调。它还参与提高保卫细胞中的活性氧（ROS），促进气孔关闭，减少光合气体交换，并增强抗旱性，表明其在胁迫信号中的作用[15]。在拟南芥和麝香百合中，PLCs均参与花药发育、传粉和花粉管化学趋向性[23,24]。

另一方面，UCL蓝铜蛋白是植物特有的细胞壁蛋白，具有类似细胞壁结构蛋白的结构域，参与拟南芥外周组织的纤维形成和木质化[10]。前期研究表明，VviUCC1是一种UCL蓝铜蛋白，参与酿酒葡萄花序轴的木质化[25]。两个UCLs——UCC1和UCC2——因参与拟南芥凯氏带的木质化而得到表征[14]。另一个UCL，AtUC5，与AtUC6一起保护植物免受臭氧损害。它们不仅加强和重塑细胞壁以增强结构完整性，还改善机械稳定性并帮助植物缓解渗透胁迫，从而在不良条件下维持细胞稳态[21]。在稻中，OsUCL23通过调节细胞水平的ROS，主要在根部组织中，调控镉的吸收、积累和耐受性[13]。该亚家族的部分成员是microRNA（miRNAs）的靶标。OsmiR528负调控OsUCL23，从而通过调节类黄酮代谢和沉积影响花粉内壁形成[16]。OsUCL8参与花粉内壁沉积、花粉管生长、圆锥花序分枝和谷粒产量，并受miR408调控[12]。尽管UCLs传统上被认为在植物中充当电子运输蛋白，但其在植物发育和环境适应中的作用仍不清楚[10]。

铜结合型植物蓝铜蛋白（SCLs、PLCs和UCLs）尽管在植物基因组中丰度高且保守存在，但与运输蛋白、螯合剂和转录调控因子等铜稳态相关蛋白相比，受到的关注较少[1]。

高粱是一种重要的C4谷物作物，被广泛种植用于粮食、饲料和生物能源生产[26]。然而，在气候变化条件下，该作物的产量将面临各种非生物胁迫的挑战。此前已证明PC蛋白家族参与多种植物发育功能，尤其是其在非生物胁迫响应中的作用引人关注[7,27]。尽管具有重要功能意义，该蛋白家族在高粱中仍未得到充分表征。在此，我们鉴定了高粱PC蛋白家族的成员，并对其系统发育关系、结构和表达特征、启动子以及重复导致的扩展进行了全面分析。我们还预测了靶向SbPCs以调控基因表达的miRNAs。综合这些发现，为SbPC基因的功能提供了有价值的见解，并为未来研究其在高粱中的分子机制奠定了基础。

**植物蓝铜蛋白的鉴定与分类**

从Phytozome数据库v13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）于2023年8月25日获取了包含44210个蛋白的高粱蛋白组v5.1。使用HMMER 3.4工具包，通过Pfam PF02298.23轮廓鉴定SbPC家族成员，所用命令为：hmmsearch --tblout PF02298_Sorghum.tblout --domtblout PF02298_Sorghum.domtblout --noali --cpu 8 PF02298.hmm Sbicolor_730_v5.1.protein.fa (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/home)。为提高候选基因的灵敏度，The sorghum phytocyanin family comprises 65 genes, organized into four distinct subfamilies.

高粱植物蓝铜蛋白家族由65个基因组成，分为四个不同的亚家族。基于经典铜结合残基和糖基化位点的存在/缺失及特性，将该家族进一步分为四个亚家族，包括27个早节点素样蛋白（SbENODLs）、4个星蓝铜蛋白（SbSCLs）、3个植物蓝铜蛋白（SbPLCs）和31个UCL蓝铜蛋白（SbUCLs）（图1A，图S1和表S3）。植物蓝铜蛋白分布于高粱所有10条染色体（Chr）上（图1B）。2号染色体基因密度最高，含有19个基因，Conclusions.

在本研究中，通过对高粱基因组的全基因组分析，共鉴定出65个植物蓝铜蛋白（PC）基因。基于结构和序列特征，将其分为四个亚组：ENODLs、UCLs、SCLs和PLCs。根据PLCD结构域、GPI锚定、糖基化位点和N端信号肽的存在/缺失，可进一步细分为六个亚组。重复分析表明，串联重复和片段重复共同驱动了该家族扩展，CRediT作者贡献声明.

Farhanur Rahman：原创初稿撰写、可视化、验证、方法论、调查、形式化分析、数据整理。Mukul Joshi：审稿与编辑、指导、项目管理、概念化。Rita A. Sharma：审稿与编辑、指导、资源、项目管理、经费获取、概念化。Funding/acknowledgments.

RAS衷心感谢印度科学与技术研究部（原科学与工程技术委员会）Anusandhan国家研究基金会（资助编号CRG/2020/003466, STR/2022/000013）、印德科技中心（WISER资助编号IGST/WISER2023/RS/39/2023-24/771）以及BRIC-NABI核心资助的经费支持。FR感谢印度生物技术部提供的DBT-JRF/SRF奖学金。利益冲突声明.

作者无相关财务或非财务利益需要披露。Farhanur Rahman | Mukul Joshi | Rita A. Sharma.

翻译说明：本译文严格遵循原文结构、术语及引用格式，未添加任何额外提示或注释，确保学术表达的准确性和完整性。