《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Growth as a phenotypic endpoint for the assessment of the impact of pollutants on water fleas - Comparisons between manual, online and AI assisted approaches
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本研究开发了一种新型、可重复的微型化方法用于水蚤（daphnids）体型测量。便携式图像采集方法可包括手机和平板电脑。AI辅助测量实现自动化。生长测量能够捕捉死亡率检测所遗漏的香烟衍生污染物的影响。研究人员开发了一种新型、可重复的微型化方法用于水蚤体型测量，该
本研究开发了一种新型、可重复的微型化方法用于水蚤（daphnids）体型测量。便携式图像采集方法可包括手机和平板电脑。AI辅助测量实现自动化。生长测量能够捕捉死亡率检测所遗漏的香烟衍生污染物的影响。研究人员开发了一种新型、可重复的微型化方法用于水蚤体型测量，该方法采用便携式图像采集设备（如手机和平板电脑），并结合AI辅助自动测量技术。研究表明，生长作为表型终点（phenotypic endpoint）能够捕捉到传统死亡率检测所遗漏的香烟衍生污染物的亚致死效应，从而为环境风险评估提供更灵敏的工具。
一、研究背景与科学问题
传统毒理学评估主要依赖死亡率等经典终点，然而这些指标往往无法反映污染物在低浓度下引发的亚致死效应。随着人类活动加剧和新化学品的不断释放，环境监测亟需更灵敏、高效的新方法。水蚤作为水生生态系统中的关键模式生物，其生理和行为反应（如游泳行为、摄食率、体长变化等）已被证实能在远低于致死浓度的水平上反映污染物的影响。其中，体长作为一项与能量分配、代谢重分配密切相关的表型终点，不仅反映个体生理状态，还与种群繁殖力直接挂钩。然而，现有的生长测定方法多沿用OECD测试指南，存在耗时长、体积大、成本高、通量低等问题，难以满足大规模化学品筛查的需求。同时，不同操作者之间的主观差异也限制了数据的可重复性。因此，开发一种微型化、标准化、可自动化的生长测定方法，对于提升生态毒理学评估的效率与可靠性具有重要意义。
二、研究目标与主要发现
针对上述问题，研究人员旨在开发一种微型化的水蚤生长测定方案，并比较手动、在线软件及AI辅助三种测量方式的精度与一致性。通过优化培养体积、藻类浓度、换液频率及动物密度等关键参数，最终建立了一个10只水蚤/10 mL培养基、每日换液、藻类浓度为120,000 cells/mL的微型化标准流程。应用该流程评估烟草及烟蒂滤嘴浸出液的毒性效应，结果显示，在非致死暴露浓度下，两种污染物均引起水蚤体长的浓度依赖性下降，最高浓度组的抑制率分别达13.5%和25.1%，证明生长终点能有效捕捉传统死亡率检测所遗漏的亚致死效应。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 1.
图像采集系统比较：对比了iPhone加放大镜头、iPad mini加放大镜头、迷你立体显微镜（Juision USB Digital Microscope）以及专业立体显微镜（OPTIKA LAB-20）四种设备的成像效果。
- 2.
测量软件评估：将手动测量软件ImageJ作为参考方法，与在线软件ImageMeasurement及基于QuPath编写的自动化测量代码进行精度比对。
- 3.
用户间变异分析：设计盲测实验，由六位不同操作者在有无预设标记点的情况下对同一组图像进行测量，以评估主观差异及监督训练的效果。
- 4.
微型化条件优化：通过单因素实验系统考察了培养体积（从50 mL降至1 mL）、藻类浓度（60,000至7,500 cells/mL）、换液频率（每天、每两天、每三天）及动物密度（5至20只/容器）对七天生长期内水蚤体长的影响。
四、研究结果
4.1 图像采集仪器比较
研究人员比较了iPhone、iPad mini、迷你立体显微镜和专业立体显微镜四种设备对同一水蚤个体的成像效果。结果表明，手机和平板电脑具备便携性优势，适合现场或教学演示；而立体显微镜则能提供更高的图像质量和放大倍数，被选为后续优化的标准采集工具。
4.2 测量软件与用户变异优化
研究人员使用ImageJ、ImageMeasurement和QuPath三种软件对新生、7日龄和18日龄三个年龄段的水蚤进行了体长测量。结果显示，ImageMeasurement受限于一位小数精度，数据呈阶梯状分布；而QuPath的自动化测量结果与ImageJ手动测量高度一致。进一步的用户间盲测表明，当未提供固定测量点时，不同操作者的测量结果存在显著差异；而在提供眼点与刺基部的标记点后，用户间变异大幅降低，测量一致性显著提升。
4.3 生长方法微型化优化
在50 mL、60,000 cells/mL藻类、每日换液、10只水蚤的参考条件下，研究人员首先绘制了10天的生长曲线，确定7天为稳定的周度观测窗口。随后单因素实验显示：体积降至25 mL和10 mL时生长分别下降11.2%和27.5%；藻类浓度降至30,000、15,000、10,000和7,500 cells/mL时生长分别下降10.6%、21.8%、30.1%和35.9%；换液频率降至每两天或每三天时生长分别下降9%和8.2%；动物数量增至15只和20只时生长分别下降4.9%和11.2%，减至5只时增长9.9%。进一步按1只/mL的密度进行微型化（1至10 mL），所有微型化版本的生长均比参考条件低12.3%-16.6%。通过提高藻类浓度至120,000 cells/mL，10只/10 mL组合的生长与50 mL参考条件无显著差异，最终确立该条件为微型化标准方案。
4.4 微型化生长方案的应用
应用上述优化方案，研究人员检测了烟草和烟蒂滤嘴浸出液对水蚤7天生长的效应。结果显示，两种污染物均引起浓度依赖性的体长减小，烟草提取物最高浓度组抑制率为13.5%，烟蒂滤嘴提取物最高浓度组抑制率为25.1%，表明该生长测定方法能够捕获非致死、亚致死水平的污染物效应。
五、讨论与结论
研究人员在讨论中指出，微型化生长测定符合3Rs原则，可减少资源消耗并提升实验通量与可重复性。AI辅助工具（如QuPath结合脚本自动化）虽仍需人工标记，但已展现出高通量筛选的潜力。此外，先进的显微成像技术（如Keyense显微镜的Z-stack与三维地形图）为进一步整合多终点同步观测提供了可能。研究结论认为，本研究所建立的微型化、可自动化且兼容便携设备的水蚤生长测定方法，能够灵敏地反映污染物的亚致死效应，为环境风险评估提供了一种高效、经济的新型工具。
