发现新型Lac-Phe衍生物，其口服吸收效果得到改善，可用于治疗代谢综合征

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of Novel Lac-Phe Derivatives with Improved Oral Exposure for the Treatment of Metabolic Syndrome

　　•基于内源性代谢物Lac-Phe，筛选出了具有较好口服暴露性的候选化合物。•化合物18对GPR40/GPR120表现出高活性，具有优异的代谢稳定性以及强效的食欲抑制作用。•化合物18改善了肥胖和脂肪肝的病理特征。

1. 引言
代谢综合征（MetS）是一种多方面的疾病，包括内脏肥胖、胰岛素抵抗（IR）、血脂异常和高血压[1]。MetS的成因与饮食中过量热量、高饱和脂肪摄入以及缺乏运动有关。MetS与许多慢性疾病密切相关，包括2型糖尿病（T2DM）、高脂血症和代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）[2]。中心性/腹部肥胖是触发MetS的关键因素，其特征是白色脂肪组织（WAT）的过度积累和脂肪组织的慢性低度炎症[3],[4]。肥胖的发病机制复杂，长期能量过剩导致的暴饮暴食被认为是其根本机制。因此，调节健康的食欲稳态和减少能量摄入是治疗肥胖和MetS的重要策略[5]。目前的食欲抑制剂主要作用于中枢食欲调节系统，但它们经常伴随显著的不良反应，包括味觉障碍、心血管风险（如西布曲明）、致癌风险（如洛卡塞林）和药物依赖性，从而严重限制了它们的临床应用[6]。最近，GLP-1受体激动剂（如Semaglutide）因显著的治疗效果而被批准用于治疗肥胖。然而，由于其注射方案的患者依从性较差以及恶心、呕吐和腹泻等胃肠道不良反应，其临床使用仍然受限[7],[8]。因此，通过调节食欲稳态，开发针对外周食欲调节靶点的更安全、更有效的食欲抑制剂成为治疗肥胖及其相关并发症的新策略。
Lac-Phe（N-乳酰苯丙氨酸，图1）是一种由运动诱导的代谢物，2022年在《自然》杂志上报道其具有抑制进食和肥胖的作用，但其具体机制尚不清楚[9]。在DIO小鼠中，注射Lac-Phe可抑制进食，而运动和能量消耗未受到影响。长期使用Lac-Phe可以减少脂肪质量和体重，并改善血糖控制。相反，缺乏Lac-Phe生物合成的小鼠在运动训练后表现出更高的食物摄入量和更严重的肥胖。然而，只有注射Lac-Phe才能抑制食物摄入和肥胖，口服Lac-Phe因代谢稳定性差而无效[9]。在这项研究中，通过对Lac-Phe进行结构修饰以提高其食欲抑制能力和代谢稳定性，从而获得具有更好口服暴露性的候选化合物。为此，一方面将Lac-Phe中的L-苯丙氨酸转化为D-氨基酸以增强其代谢稳定性；另一方面引入了额外的取代基团以探索结构-活性关系，并识别出具有增强食欲抑制效果的化合物（图1）。经过全面的结构-活性关系研究，基于其对GPR40/GPR120的高活性、优异的代谢稳定性和强效的食欲抑制作用，选出了候选化合物18。

2. 结果与讨论
2.1. 化学
目标分子1-7和8-15的合成路线分别见方案1A和1B。如方案1A所示，商业购买的(S)-2-氨基-3-苯丙酸甲酯盐酸盐经过连续的酰胺偶联反应生成相应的中间体1-7a。这些中间体通过柱层析分离后，再用LiOH·H2O进行碱性水解，得到最终产物1-7。同样，化合物8-15的制备（方案1B）从商业前体8-15a开始，通过一系列酰胺缩合反应转化为中间体8-15b，然后通过LiOH·H2O催化的水解得到目标化合物8-15。
表1. 结构修饰对Lac-Phe抑制GPR40/GPR120活性及代谢稳定性的影响

2.2. 结构-活性关系（SAR）研究
为了提高Lac-Phe的代谢稳定性和食欲抑制效果，我们将其L-苯丙氨酸转化为D-氨基酸，并引入了额外的取代基团以探索结构-活性关系。此外，Charles S. Zuker团队在《自然》杂志上报道了“脂肪 addiction”背后的肠道-大脑轴神经回路：G蛋白偶联受体40（GPR40）和GPR120协同感知脂质信号，并激活脑干中的孤束尾核，从而引发对高脂肪饮食的“依赖”[10]。同时敲除GPR40和GPR120可以完全消除小鼠对膳食脂肪的偏好，从而调节食欲稳态，而不影响正常的味觉感知。相比之下，单独敲除GPR40或GPR120无法阻断这一回路[10],[11],[12]。然而，迄今为止报道的GPR40/GPR120双重抑制剂较少，已知的一些单一靶点抑制剂包括GPR40抑制剂DC260126和GPR120抑制剂AH-7614。在本研究中，Lac-Phe在体外显示出对GPR40/GPR120的中等程度的功能性抑制作用，尽管这些相互作用的生理意义仍有待确定。因此，评估了GPR40/GPR120的抑制活性、食欲抑制效果以及肝微粒体的稳定性，以监测治疗效果和代谢稳定性。
表2. 结构修饰对Lac-Phe抑制活性的影响

为了进一步提高Lac-Phe的代谢稳定性和食欲抑制效果，我们将L-苯丙氨酸转化为D-氨基酸，并引入了额外的取代基团。Charles S. Zuker团队在《自然》杂志上报道了“脂肪 addiction”背后的肠道-大脑轴神经回路：G蛋白偶联受体40（GPR40）和GPR120协同感知脂质信号，并激活脑干中的孤束尾核，从而引发对高脂肪饮食的“依赖”[10]。同时敲除GPR40和GPR120可以完全消除小鼠对膳食脂肪的偏好，从而调节食欲稳态，而不影响正常的味觉感知。相比之下，单独敲除GPR40或GPR120无法阻断这一回路[10],[11],[12]。然而，迄今为止报道的GPR40/GPR120双重抑制剂很少，已知的一些单一靶点抑制剂包括GPR40抑制剂DC260126和GPR120抑制剂AH-7614。在本研究中，Lac-Phe在体外显示出对GPR40/GPR120的中等程度的功能性抑制作用，尽管这些相互作用的生理意义仍有待确定。因此，评估了GPR40/GPR120的抑制活性、食欲抑制效果以及肝微粒体的稳定性。
表2. 结构修饰对Lac-Phe抑制活性的影响

为了进一步提高Lac-Phe的代谢稳定性和食欲抑制效果，我们将L-苯丙氨酸转化为D-氨基酸，并引入了额外的取代基团。此外，Charles S. Zuker团队在《自然》杂志上报道了“脂肪 addiction”背后的肠道-大脑轴神经回路：G蛋白偶联受体40（GPR40）和GPR120协同感知脂质信号，并激活脑干中的孤束尾核，从而引发对高脂肪饮食的“依赖”[10]。同时敲除GPR40和GPR120可以完全消除小鼠对膳食脂肪的偏好，从而调节食欲稳态，而不影响正常的味觉感知。相比之下，单独敲除GPR40或GPR120无法阻断这一回路[10],[11],[12]。然而，到目前为止报道的GPR40/GPR120双重抑制剂很少，已知的一些单一靶点抑制剂包括GPR40抑制剂DC260126和GPR120抑制剂AH-7614。在本研究中，Lac-Phe在体外显示出对GPR40/GPR120的中等程度的功能性抑制作用，尽管这些相互作用的生理意义仍有待确定。因此，评估了GPR40/GPR120的抑制活性、食欲抑制效果以及肝微粒体的稳定性。
表2. 结构修饰对Lac-Phe抑制活性的影响

基于上述研究，我们进一步引入了不同取代基团的苯丙氨酸以探索结构-活性关系。如表2所示，4-苄氧基衍生物14表现出比Lac-Phe更高的GPR40/GPR120抑制活性和肝微粒体稳定性，这有助于其更好的食欲抑制效果。然而，当乳酸被丙酸取代时（化合物13），活性显著下降。基于之前的优选化合物5，在当前系列中引入了异丙基，但活性并未明显改善。有趣的是，4-苄氧基衍生物14和15显示出增强的肝微粒体稳定性。尽管将乳酸（Lac-Phe）转化为丙烯酸（4）略微降低了体外和体内的抑制活性和食欲抑制效果，但将甲基（Lac-Phe）替换为异丙基（5）显著增强了GPR40/GPR120的抑制活性和食欲抑制效果，表明异丙基可能与这些受体具有更匹配的疏水相互作用。此外，化合物5在肝微粒体中的稳定性优于Lac-Phe。虽然在苯环的对位引入氟原子（9）进一步提高了代谢稳定性，但化合物9的活性略低于化合物5。然而，在苯环（6）或苄基（7）的位置引入导致GPR40/GPR120的抑制活性和食欲抑制效果显著下降，表明该位置的疏水口袋无法容纳较大的取代基团。由于羟基在抑制食欲中仍有一定作用，我们保留了它，并将修改重点转移到了代谢不稳定的肽键上。天然氨基酸容易受到酶（如肽酶或氨基酸代谢酶）的降解，导致代谢稳定性差，而非天然苯丙氨酸可以增强对代谢酶的抵抗力。令人惊讶的是，将L-苯丙氨酸（Lac-Phe）转化为D-苯丙氨酸（8）略微增强了对GPR40/GPR120的抑制活性。如预期，非天然苯丙氨酸显著提高了肝微粒体的稳定性（HLM剩余：90%），从而提供了几乎是Lac-Phe两倍的食欲抑制效果。同样，D-衍生物10也表现出比L-衍生物3更好的代谢稳定性，同时保持相似的生物活性。然而，将化合物5中的L-苯丙氨酸替换为D-苯丙氨酸（11）导致GPR40/GPR120的抑制活性显著下降，尽管代谢稳定性有所提高。此外，环丙烷羧酸（12）的引入在这个系列中是可耐受的。
表2. 第二轮结构-活性关系研究

为了进一步验证结构优化对药代动力学（PK）的影响，我们评估了Lac-Phe及其D-构型衍生物8和18在大鼠中的PK特性。如表3所示，D-构型衍生物8的最大血浆浓度（Cmax = 1251.80 ng/mL）和半衰期（T1/2 = 1.89 h）显著优于Lac-Phe（Cmax = 258.17 ng/mL，T1/2 = 0.84 h）。这些结果表明，用非天然D-构型氨基酸替换天然L-构型氨基酸确实显著增强了体内的代谢稳定性。值得注意的是，衍生物18的半衰期为3.71 h，AUC0-t为7857.17 ng·h/mL，比Lac-Phe（AUC0-t = 668.49）高出10倍。这些PK特性的改善也合理解释了为什么衍生物8和18在体内具有更强的食欲抑制效果。
表3. 结构修饰对Lac-Phe抑制活性的影响**Lac-Phe及其D构型衍生物8和18在SD大鼠中的PK结果（50 mg/kg，口服）**
| 参数 | Lac-Phe | 化合物8 | 化合物18 |
|------------|---------|---------|---------|
| Tmax (h) | 1.00 ± 0 | 1.00 ± 0 | 1.00 ± 0 |
| Cmax (ng/mL) | 258.17 ± 23.56 | 1251.80 ± 150.48 | 1528.60 ± 174.81 |
| T1/2 (h) | 0.84 ± 0.01 | 1.89 ± 0.09 | 3.71 ± 0.51 |
| AUC0-t (ng·h/mL) | 668.49 ± 44.26 | 4715.18 ± 871.88 | 7857.17 ± 1799.33 |

**2.3 分子模拟研究**
为了更好地理解化合物18与GPR40/GPR120的结合模式，我们进行了分子模拟研究（图3）。分子对接模拟表明，该化合物与两种受体靶点中的关键氨基酸残基建立了广泛的相互作用。在GPR40结合口袋内，化合物18的负电荷羧基可能通过与ARG-183和ARG-258形成盐桥或氢键而稳定。此外，化合物的羧基部分与LEU-171发生氢键结合，而其酰胺基团与TYR-240和TYR-91相互作用。在GPR120的情况下，化合物18的羧基与ASN-291、LEU-288和GLU-204形成氢键网络，同时其酰胺功能与TRP-198相互作用。总体而言，这些结构发现表明化合物18与这两种受体的结合口袋具有高度的结构互补性，有效地占据了正交位点，从而阻止了激动剂的结合。

**2.4 在DIO小鼠中的体内疗效**
DIO小鼠表现出典型的代谢综合征表型，表现为体重增加、高脂血症和肝脂肪变性。化合物18的口服给药剂量依赖性地减少了体重、食物摄入量和肝质量（图4A）。值得注意的是，即使在50 mg/kg的较低剂量下，化合物18也表现出与Lac-Phe（150 mg/kg）相当的效果（图4B-E），并且在血糖控制方面表现更优（图4F）。此外，化合物18处理显著减轻了肝脂肪变性并抑制了脂肪细胞肥大（图4G），高剂量组（300 mg/kg）的脂肪细胞尺寸与健康对照组相似。此外，干预还显著减少了白色脂肪组织的质量（图4H）并显著降低了血清中的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平（图4I）。肝脂质谱也以剂量依赖的方式得到改善，肝脏中的TG、TC和非酯化脂肪酸（NEFA）含量降低（图4J）。总体而言，这些发现表明化合物18在改善代谢综合征方面比Lac-Phe具有更高的治疗效果。

**2.5 化合物18调节DIO小鼠中的PI3K/Akt/mTOR信号通路**
为了揭示化合物18对DIO小鼠代谢综合征治疗效果的分子机制，我们对肝组织进行了基于RNA-seq的全转录组分析。火山图分析确定了18-H（300 mg/kg）治疗组与DIO对照组之间有593个显著差异表达的基因（DEGs），包括270个上调基因和323个下调基因（图6A）。基因本体论（GO）富集分析表明，18-H干预显著影响了与脂肪酸代谢和分解代谢相关的生物过程（图6B）。随后的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，DEGs在自噬相关、MAPK和PI3K-Akt通路中显著富集，其中PI3K/Akt轴的富集程度最高（图6C）。此外，基因集富集分析（GSEA）显示，处理组表现出溶酶体和自噬相关通路的明显激活（图6D）。与这些发现一致，热图聚类显示18-H处理显著重新编程了控制自噬和脂肪酸分解代谢的关键基因的表达模式（图6E-F）。总体而言，这些转录组学发现表明，化合物18可能通过调节PI3K/AKT信号通路、刺激自噬和促进脂肪酸代谢来改善肥胖和代谢功能障碍。

**2.6 在FFA诱导的HepG2细胞中的体外疗效**
鉴于化合物18在改善肝脂肪变性方面的潜力，我们评估了其在FFA诱导的HepG2细胞中的治疗效果。初步的安全性分析表明，化合物18在高达40 μM的浓度下仍能维持HepG2细胞的活力（图8A），从而确定了其安全的治疗窗口。为了模拟体内的脂质积累，HepG2细胞被暴露于游离脂肪酸（FFAs），随后用化合物18处理。通过对甘油三酯（TG）和非酯化脂肪酸（NEFA）的定量分析，并结合Oil Red O组织学观察，发现FFA刺激显著加剧了细胞内的脂质沉积。然而，化合物18的给药有效地逆转了这种脂毒性表型，显著减轻了脂质积累并以剂量依赖的方式恢复了代谢稳态（图8B–E）。

**2.7 在WD+CCl4诱导的MASH模型中的体内疗效**
为了评估化合物18对抗脂肪肝疾病的治疗潜力，我们使用了一种由西方饮食和四氯化碳诱导的小鼠MASH模型，该模型在组织和转录组特征上与人类患者相似。尽管该模型一定程度上模拟了人类MASH的一些指标，但需要注意的是，该模型仍存在局限性，包括CCl4的化学毒性、纤维化模式/代谢严重程度可能与人类MASH不同，仅WD喂养引起的代谢异常可能会被稀释。因此，应将该模型与DIO模型结合使用以更好地评估候选化合物的效果。我们的研究表明，MASH诱导导致了显著的肝脂肪变性、肝肿大以及血清脂质（TG、TC、LDL-C）和肝脂质（TG、TC、FFA）水平的升高（图9B-D）。化合物18或OCA的治疗显著改善了肝脂肪变性，并降低了血清和肝脏中的脂质浓度。通过H&E染色进行的组织学检查确认该模型成功再现了MASH的关键特征，包括脂肪变性、小叶炎症以及含有Mallory-Denk小体的肝细胞气球样变。化合物18和OCA均有效减轻了这些病理特征，并降低了肝脏中的炎症细胞因子水平（图9E-G）。此外，使用NAFLD活动评分（NAS）进行评估时，评分≥5表示MASH，结果表明化合物18的治疗效果与OCA相当（图9H）。

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图9. 化合物18缓解了MASH小鼠的组织学特征。(A) MASH模型实验概述，(B) 肝脏重量和肝脏与体重之比，(C) 血清TG、TC、LDL-C，(D) 肝脏TG、TC、FFA，(E) H&E染色的肝脏切片，脂肪变性（蓝色箭头），小叶炎症（黄色箭头）和肝细胞气球样变（橙色箭头），(F) 肝脏IL-6、IL-1β，(G) TNF-α、MCP-1，(H) 总NAFLD活动评分。数据以平均值±标准差表示（n = 6）。#p < 0.05，###p < 0.001与正常组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与模型组相比；&P < 0.05，&&P < 0.01，&&&P < 0.001两组之间比较。组间比较通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验进行多重比较。刻度条，100 μm。

2.8. 化合物18调节MASH小鼠中的多种机制
氧化应激是MAFLD的关键病理生理驱动因素，它导致的炎症细胞募集和肝细胞损伤进一步加速了MASH的进展。在正常情况下，抗氧化防御系统——包括谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）等酶——可以减轻氧化损伤。相反，丙二醛（MDA）作为一种脂质过氧化产物，是细胞损伤严重程度的标志物。如图10A所示，接受OCA或化合物18治疗的小鼠表现出SOD和GST活性的显著恢复以及GSH水平的升高，而MDA浓度相对于MASH模型组显著降低。此外，化合物18干预还有效降低了血清ALT和AST水平（图10B）。

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图10. 化合物18对MASH小鼠肝纤维化的影响。(A) 肝脏SOD、GSH、GST、MDA水平（n = 6），(B) 血清AST、ALT、ALP、TBA、TBIL（n = 6），(C) Masson染色的肝脏切片（n = 6），(D) Masson阳性染色面积的量化（n = 6），(E) 肝脏TGF-β水平（n = 6），(F) 肝脏HYP水平（n = 6），(G) 西部印迹法检测Beclin-1、LC3B和β-actin的蛋白质表达（n = 3）。数据以平均值±标准差表示。###p < 0.001与正常组相比；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与模型组相比；&P < 0.05，&&P < 0.01，&&&P < 0.001两组之间比较。组间比较通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验进行多重比较。刻度条，100 μm。
鉴于大约15%的MASH病例会发展为严重的纤维化，并考虑到CCl4诱导的模型能够有效模拟纤维化病理，我们通过Masson染色来评估肝纤维化。模型组显示出广泛的纤维化，其特征为纤维融合和明显的桥接（图10C）。然而，半定量分析显示治疗组的纤维化阳性面积显著减少（图10D）。与这些组织学发现一致，关键的纤维化生物标志物羟脯氨酸（HYP）在所有治疗组中显著降低（图10E）。此外，结果表明化合物18通过下调肝TGF-β的表达来发挥其抗纤维化作用，TGF-β是一种公认的促纤维化细胞因子（图10F）。总体而言，这些数据表明化合物18对MASH相关的肝纤维化的抑制效果与OCA相当。

最后，为了探究潜在机制，我们评估了不同浓度化合物18处理后肝脏中自噬相关蛋白的表达情况（图10G）。相对于对照组，化合物18的剂量依赖性上调了Beclin的表达，并增加了LC3B-II/I比率和LC3B-II/β-actin比率。这些观察结果表明化合物18也在MASH模型中促进了自噬通量。

3. 结论
Lac-Phe是一种运动诱导的代谢物，可以抑制进食和肥胖，但其具体机制尚不清楚。然而，只有注射Lac-Phe才能抑制食物摄入和肥胖，因为口服Lac-Phe由于代谢稳定性差而无效。在这项研究中，对Lac-Phe进行了结构修饰，以改善食欲抑制和代谢稳定性，从而获得具有更好口服暴露效果的候选物。通过引入D-氨基酸和系统的结构-活性关系研究，基于其优异的代谢稳定性和显著的食欲抑制作用，确定了化合物18。此外，化合物18对GPR40/GPR120表现出强烈的双重功能抑制。化合物18通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路显著改善了肥胖和脂肪肝，从而促进了DIO和MASH模型中的自噬和脂质代谢。总的来说，这些发现表明化合物18是一种强有力的治疗候选物，扩展了代谢性疾病的治疗药物谱。

4. 实验部分
4.1. 化学
所有化学试剂和溶剂均从商业供应商处获取，作为分析级材料使用，除非另有说明，否则无需进一步纯化。反应监测和产品纯化分别通过GF254板上的薄层色谱（TLC）和硅胶柱色谱（200–300目）进行。光谱表征使用Bruker AVANCE光谱仪进行1H和13C NMR分析。高分辨率质谱（HRMS）数据使用AB SCIEX X500R系统获得。

4.1.1. 方案1的一般程序
向(S)-2-氨基-3-苯丙酸盐酸盐（1.0当量）在二氯甲烷（10 mL）的溶液中依次加入HBTU（1.2当量）、DIPEA（3.0当量）和相应的酸（1.2当量）。在室温下搅拌混合物4小时后，减压浓缩。残留物在乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液之间分配，然后用1 N HCl萃取。合并的有机层在减压下干燥并浓缩，粗产品通过柱色谱纯化得到中间体1-7a。随后，将1-7a溶解在THF/MeOH/H2O（3:3:1, v/v/v, 14 mL）混合物中，并加入LiOH·H2O（1.5当量）。在室温下搅拌4小时后，通过旋转蒸发去除挥发性物质。剩余的水相用1 N HCl酸化并用乙酸乙酯萃取。有机萃取物浓缩并干燥，得到最终产物1-7。

(S)-2-羟基丙酰)-L-苯丙氨酸（1）的产率：51%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 – 7.24 (m, 2H), 7.23 – 7.19 (m, 1H), 7.19 – 7.15 (m, 2H), 4.51 (td, J = 8.0, 5.2 Hz, 1H), 3.93 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 13.7, 5.1 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 13.7, 8.0 Hz, 1H), 1.10 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 174.17, 172.74, 137.20, 129.28, 128.17, 126.52, 67.11, 52.36, 36.62, 21.02。ESI-MS m/z: [M?H]– 计算值 C12H14NO4-, 236.0928; 实测值, 236.0920。
乙酰-L-苯丙氨酸（2）的产率：88%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 12.64 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.31 – 7.25 (m, 2H), 7.25 – 7.17 (m, 3H), 4.40 (td, J = 9.1, 5.0 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 13.8, 4.9 Hz, 1H), 2.83 (dd, J = 13.8, 9.6 Hz, 1H), 1.78 (s, 3H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 173.20, 169.26, 137.75, 129.07, 128.20, 126.42, 53.52, 36.79, 22.35。ESI-MS m/z: [M? H]– 计算值 C11H12NO3-, 206.0823; 实测值, 206.0821。
丙酰-L-苯丙氨酸（3）的产率：62%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 12.63 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 – 7.24 (m, 2H), 7.24 – 7.16 (m, 3H), 4.41 (td, J = 9.1, 4.9 Hz, 1H), 3.05 (dd, J = 13.8, 4.8 Hz, 1H), 2.84 (dd, J = 13.7, 9.7 Hz, 1H), 2.05 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 0.90 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 173.25, 172.93, 137.77, 129.10, 128.14, 126.38, 53.33, 36.80, 28.22, 9.79。ESI-MS m/z: [M? H]– 计算值 C12H14NO3-, 220.0979; 实测值, 220.0971。
(S)-2-羟基丁酰)-L-苯丙氨酸（4）的产率：58%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 12.82 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.30 – 7.23 (m, 2H), 7.22 – 7.14 (m, 3H), 5.51 (s, 1H), 4.54 (td, J = 8.2, 5.1 Hz, 1H), 3.78 (s, 1H), 3.09 (dd, J = 13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.00 (dd, J = 13.8, 8.2 Hz, 1H), 1.59 – 1.49 (m, 1H), 1.43 – 1.33 (m, 1H), 0.72 (t, J = 7.4 Hz, 3H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 173.44, 172.79, 137.26, 129.20, 128.16, 126.48, 71.80, 52.39, 36.70, 31.23, 19.12, 15.94。ESI-MS m/z: [M? H]– 计算值 C13H16NO4-, 250.1085; 实测值, 250.1081。
(S)-2-羟基-3-甲基丁酰)-L-苯丙氨酸（5）的产率：55%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 12.78 (s, 1H), 7.65 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.28 – 7.23 (m, 2H), 7.22 – 7.15 (m, 3H), 4.56 (td, J = 8.4, 5.1 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 3.08 (dd, J = 13.9, 5.0 Hz, 1H), 3.00 (dd, J = 13.9, 8.6 Hz, 1H), 1.94 – 1.80 (m, 1H), 0.79 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.57 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 173.08, 172.84, 137.34, 129.15, 128.19, 126.46, 53.33, 36.80, 27.31, 9.14。ESI-MS m/z: [M? H]– 计算值 C14H18NO4-, 264.1241; 实测值, 264.1238。
(S)-2-羟基-2-苯乙酰)-L-苯丙氨酸（6）的产率：55%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 12.87 (s, 1H), 8.06 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.38 – 7.30 (m, 2H), 7.30 – 7.21 (m, 5H), 7.20 – 7.13 (m, 2H), 7.13 – 7.07 (m, 1H), 6.22 – 6.08 (m, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.47 (td, J = 8.4, 4.2 Hz, 1H), 3.09 (dd, J = 13.8, 4.3 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 13.6, 8.4 Hz, 1H)。13C NMR（101 MHz, DMSO-d6）δ 172.66, 171.83, 141.15, 137.31, 129.19, 128.21, 127.85, 127.34, 126.80, 126.47, 73.05, 52.90, 36.50。ESI-MS m/z: [M? H]– 计算值 C17H16NO4-, 298.1085; 实测值, 298.1081。
(S)-2-羟基-3-苯丙酰)-L-苯丙氨酸（7）的产率：61%。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 4.4 动物实验
雄性C57BL/6小鼠（5–6周龄）和雄性SD大鼠（180-200克）由广东医学实验动物中心提供。这些动物被饲养在广东药学院的实验动物中心内，处于特定的无病原体环境中，温度保持在23 ± 2°C，湿度为50 ± 10%，并采用12小时光/暗周期。经过7天的适应期后，允许它们自由摄取食物和水。所有实验方案均获得了广东药学院动物护理和使用委员会的批准，并按照中国实验动物管理 regulations 以及 NIH 实验动物护理和使用指南（NIH 出版物编号85–23，2011年修订版）进行。

为了评估食欲抑制作用，将6周大的雄性C57BL/6小鼠（每组6只）在适应期后转为高脂肪饮食（HFD）。小鼠每天接受腹腔注射溶媒或测试化合物，剂量为50毫克/千克。为了确保初始组间没有显著差异，将基线体重进行匹配。在7天的时间内，每天固定时间监测食物摄入量和体重。

在SD大鼠中评估了Lac-Phe及其D-构型衍生物8和18（50毫克/千克）的药代动力学（PK）特征。单次口服给药后，在特定时间点（0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时）采集血液样本。样品在12,000 g下离心10分钟。然后，将50 μL血浆上清液与50 μL内标混合物混合，加入200 μL甲醇沉淀3分钟后，再次在相同条件下离心。随后，使用PyMOL分子图形系统（版本2.5.0）对上层200 μL样品进行可视化处理。

4.5 饮食诱导肥胖（DIO）模型
小鼠被随机分配接受为期16周的高脂肪饮食（D12492，Dyets）。从第17周开始，每天通过口服给予Lac-Phe（150毫克/千克）或化合物18的不同剂量（低剂量18-L，50毫克/千克；中等剂量18-M，150毫克/千克；高剂量18-H，300毫克/千克），持续4周。所有动物都可以自由飲用水，整个给药期间每天记录体重和食物摄入量。

通过给小鼠喂食高脂肪饮食（D18061501，Dyets）以及含高糖水（23.1克/升葡萄糖和18.9克/升果糖），同时每周腹腔注射CCl4（0.3微升/克），建立了与代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎（MASH）模型。从第9周开始，每天通过口服给予OCA（20毫克/千克）或化合物18的不同剂量（50毫克/千克、150毫克/千克、300毫克/千克），持续4周。

4.6 细胞培养和肝细胞脂肪变性诱导
HepG2细胞在添加了15%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，温度为37°C，培养箱内含有5%的二氧化碳。当细胞密度达到80%–90%时，将其接种到6孔板中。为了建立肝脂肪变性模型，使用了一种由油酸和棕榈酸（OA:PA = 2:1）组成的游离脂肪酸（FFA）混合物。细胞附着后，更换培养基：对照组使用无血清DMEM，而实验组则暴露于1 mM FFA中24小时。脂肪变性诱导后，定量测定细胞内甘油三酯（TG）和非酯化脂肪酸（NEFA）的水平，并通过Oil Red O（ORO）染色评估脂质积累情况。

4.7 口服葡萄糖耐量测试（OGTT）
在体内实验结束后，小鼠需禁食12小时，然后进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。通过口服给予4克/千克的葡萄糖负荷，使用血糖仪在给药后0、30、60和90分钟采集尾静脉血液样本，测定血糖浓度。总体葡萄糖耐量通过计算曲线下面积（AUC）来定量评估。

4.8 体外肝微粒体代谢稳定性检测
测试化合物和内标（IS）分别以500 ng/mL和2.5 ng/mL的甲醇溶液形式制备。按照北京辉智泰康公司提供的I期代谢稳定性试剂盒说明书，将182 μL 0.1 M PBS缓冲液、10 μL溶液A、2 μL溶液B和1 μL测试化合物（500 ng/mL）混合在1.5 mL离心管中，于37°C预孵育5分钟。然后加入5 μL人肝微粒体启动反应。为了评估代谢稳定性，在反应开始后0分钟和30分钟分别加入200 μL冰冻甲醇终止反应。将生成的400 μL混合物振荡3分钟后离心12,000转/分钟。收集上清液，分析0分钟和30分钟时分析物峰面积与内标峰面积的比值。

4.9 生化检测
使用Beckman Coulter AU5811自动生化分析仪（日本东京）测定血清生化参数，包括TG、TC、LDL-C、ALT、AST、ALP、TBA、TBIL、DBIL和IBIL。使用南京建成生物工程研究所的 comercial assay kits 测定肝脏中的TC、TG、NEFA和FFA水平。此外，还通过相应 commercial kits 测定SOD、GSH、GST、MDA和HYP的浓度。为了评估炎症和纤维化标志物，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测定IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和TGF-β的肝脏含量。所有实验操作严格遵循各自制造商的说明书进行。

4.10 RNA提取和RNA测序
使用Eastep Super Total RNA提取试剂盒（目录号：LS1040，Promega，上海）提取总RNA，为下游转录组分析准备样品。原始测序数据通过Illumina HiSeq平台生成，并转换为FASTQ格式。为了确保数据质量，使用Trimmomatic去除适配器序列、低质量碱基和含有模糊核苷酸（N）的读段。高质量纯净读段随后使用HISAT2映射到参考基因组。使用多种工具进行比对后质量评估：RSeQC用于检测读段重复；BEDTools用于评估基因覆盖度；Qualimap用于分析读段在外显子、内含子和基因间区域的分布。还通过可视化染色体读段分布来确认测序覆盖的均匀性。

差异表达分析采用DESeq2软件进行，设定了显著性阈值qValue < 0.05和log2倍数变化 > 1或< -1。为了阐明差异表达基因的生物学意义，进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析以及基因集富集分析（GSEA）。这一全面的生物信息学流程确保了结果的稳健性和可重复性，从而深入揭示了研究样本的转录组特征。

4.11逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
从肝组织中提取总RNA并测定其浓度，随后将其逆转录为cDNA。通过RT-qPCR测定目标基因mRNA的表达水平，相对表达水平使用2^?ΔΔCt方法计算，以GAPDH作为内参（表4）。

表4. 用于定量PCR的小鼠引物序列
基因 | 正向引物（5’-3’） | 反向引物（5’-3’）
ACC1 | GCTGCCCACATCCCATCCAAACGCTGACAAGGTGGCGTGAAGG | FAST | AAAGCATGACCTCGTGATGAAGAAGTTCAGTGAGGCGTAGTAG
SREBP-1 | c | SCD1 | GCTACCGGTCTTCTATCAATGAAACATTCAATCCCGGGAGAATACGCAAGACAGCAGATTTATTCAGAAACTTTCTTCCGGTCGTAAG | LPLC | CTGATGACGCTGATTTTGTAGCAATGAAGAGATGAATGGAGCGA
Apo-C-Ⅱ | TGCCAAGGAGGTTGCCAAAGACATGCCTGCGTAAGTGCTCATGGA | Po-C-Ⅱ | IGAAGGGAAGAAACAAAGAGCTGAAGGATCCCTCTACCTCTTCAGANGPTL3 | AACAGCAAGACAACAGCATAAGCTGAGGGTTCTTGAATACCAGTCPT1α | AGCCAGACTCCTCAGCAGCAGCACCATAGCCGTCATCAGCAACCLCADGGCCGGAAGCTGCATAAGATGGAGTAAGGCATTAGCTGGCAATCGGATGLTCGCAATCTCTACCGCCTCCACCACAGCAGCTTCCGADPHGGTTGTCTCCTGCGACTTCATGGTCCAGGGTTTCTTACTCC |

4.11 西部印迹（Western blots）
使用含有1× PMSF蛋白酶抑制剂（Meilunbio）的RIPA裂解缓冲液（PR20035，Proteintech）从肝组织中提取总蛋白。蛋白定量后，用1× PBS稀释样品至相同浓度，并与5× SDS-PAGE上样缓冲液（P1040，Solarbio）以1:4的比例混合。混合物在97°C下变性5分钟。蛋白在5%、10%或12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后转移至0.2-或0.45-μm PVDF膜（Merck Millipore）。用5%无脂干牛奶在TBST（50 mM Tris-HCl pH 7.6，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）中封闭1小时后，将膜在4°C下与以下一抗孵育过夜：Beclin-1（1:2000，abcam，ab207612）、LC3B（1:2000，abcam，ab192890）、PI3K（1:1000，abcam，ab191606）、p-PI3K（1:200，abcam，ab278545）、AKT（1:1000，abcam，ab81283）、p-AKT（1:1000，Hua'an Biology，ET1607-73）、mTOR（1:5000，abcam，ab32028）、p-mTOR（1:5000，abcam，ab109268）和β-actin（1:5000，Proteintech，20536-1-AP）。膜然后用TBST洗涤三次（每次5分钟），接着与HRP标记的山羊抗兔二抗（1:5000，Proteintech，SA00001-2）孵育1小时（25°C），之后再次洗涤TBST。使用超灵敏ECL底物（BL520B，Biosharp）检测免疫反应条带，并在Tanon 5200CE化学发光成像系统上观察。条带强度使用ImageJ软件量化，所有数据以平均值±标准差（SD）表示。

4.12 统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism软件（版本8.0.2）进行。数据以平均值±标准差（SD）表示。组间比较通过单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey的后验检验进行多重比较，p < 0.05视为统计学显著。

CRediT作者贡献声明
Bei Ni：正式分析、数据管理、概念设计。
Jianming Mao：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理、概念设计。
Zheng Li：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、数据管理、概念设计。
Kaiqi Wu：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理、概念设计。
Xiaojuan Xu：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、数据管理、概念设计。
Qianqian Qiu：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理、概念设计。
Minghui Deng：正式分析、概念设计。
Lanfang Li：正式分析、数据管理、概念设计。
Yinuo Bu：正式分析、概念设计。
Lili Yang：数据管理、概念设计。
Zhiying You：方法学、数据管理。
Xiyan Qian：方法学、数据管理。
Lu Yu：数据管理、概念设计。

4.10 伦理声明
本研究遵循以下动物福利和/或报告指南进行：中国实验动物管理 regulations 和 NIH 实验动物护理和使用指南（NIH 出版物编号85–23，2011年修订版）。该项目获得了广东药学院的批准。

作者名单：Qianqian Qiu | Kaiqi Wu | Jianming Mao | Bei Ni | Lanfang Li | Minghui Deng | Yinuo Bu | Lu Yu | Xiyan Qian | Zhiying You | Lili Yang | Xiaojuan Xu | Zheng Li