基于蛋白质组学的计算方法鉴定福氏耐格里虫中与TLR1/2结合的组织蛋白酶B毒力因子并设计一种新型多表位疫苗候选物

《Experimental Parasitology》：Proteome-based computational identification of cathepsin B as a TLR1/2-binding virulence factor in Naegleria fowleri and design of a novel multi-epitope vaccine candidate

　　

**• 福氏耐格里阿米巴蛋白质组学分析揭示了组织蛋白酶B作为一种潜在的毒力因子。**
• 福氏耐格里阿米巴的组织蛋白酶B有可能与人类TLR1/2形成稳定的复合物。
• 利用组织蛋白酶B的免疫反应性T细胞和B细胞表位，结合TLR佐剂，设计了一种新型疫苗构建体。

**1. 引言**

由寄生虫阿米巴引起的脑炎主要靶向中枢神经系统（CNS），人类中有两种主要的临床形式：原发性阿米巴脑膜脑炎（PAM）和肉芽肿性阿米巴脑炎（GAE）（Ahmad Zamzuri 等，2023）。PAM曾被认为是罕见疾病，但近年来这种被忽视的热带病（NTD）频繁登上新闻头条（Ahmad Zamzuri 等，2023）。PAM于1965年由Fowler和Carter在澳大利亚首次报道（Fowler和Carter，1965）。自那以来，全球已报道超过380例病例（Gharpure 等，2021），美国超过165例（CDC，2025a）。PAM已在33个国家被报道，其中大多数病例记录在美国、巴基斯坦、墨西哥、印度、澳大利亚、泰国和捷克共和国（Gharpure 等，2021；Güémez和García，2021；Nadeem 等，2023）。2024年，印度各地报告了PAM感染的激增，特别是在西孟加拉邦、安得拉邦、特伦甘纳邦、卡纳塔克邦、喀拉拉邦和泰米尔纳德邦（Joseph 等，2022；Iyer 等，2024）。重要的是，2025年喀拉拉邦确认了153例PAM病例，致病病原体为福氏耐格里阿米巴（N. fowleri）（Desai 等，2025）。这种急性暴发性疾病也称为耐格里虫病（Naegleriasis），由脑细胞和神经元遭受严重损害所致，最终导致大量死亡，致死率超过97%（Haston和Cope，2023；CDC，2025b）。

福氏耐格里阿米巴是一种兼性寄生虫，俗称"食脑阿米巴"，是这种出血性坏死性脑炎的致病病原体，它最常见于各种淡水来源，如温泉、池塘、湖泊、氯含量不足的游泳池、喷泉、温热水库、未处理的饮用水以及水上乐园（Güémez和García，2021；Borkens，2024；Rojo 等，2023）。因此，93%的PAM病例与水暴露有关（Maciver 等，2020）。罕见的例外是，2023年一项报告将PAM发病追溯到海水暴露（Wang 等，2023）。

这种嗜热自由生活阿米巴（FLA）属于瓦姆匹科虫科（Vahlkampfiidae）裂殖目（Schizopyrenida）。根据环境条件，它自然以三种形态存在：包囊、滋养体和一个梨形的临时鞭毛体（Iyer 等，2024；Jahangeer 等，2020）。它通常以革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为食，但滋养体偶尔也会摄取藻类和酵母。其繁殖方式为二分裂，其嗜热性要求在35至46°C的温度范围内才能更好地发育（Güémez和García，2021）。在游泳或其他类似活动中暴露于污染水的人群会遭受滋养体的侵害，滋养体通过鼻腔进入并向上迁移附着于鼻黏膜。阿米巴随后侵袭该层以获取嗅感觉轴突束（嗅神经）并到达嗅球。通过这些神经通路穿透筛板后，阿米巴进入宿主的中枢神经系统，最终绕过或破坏血脑屏障（Borkens，2024；Martínez-Castillo 等，2017）。

福氏耐格里阿米巴利用其"食物杯"——一种类似吸盘的表面结构来消化脑组织，同时释放细胞溶解性分子，引发进一步的神经破坏（Jahangeer 等，2020）。感染者无法将福氏耐格里阿米巴传播给他人，因此该病不具有传染性。感染症状通常在暴露后3至7天内出现，发病迅速且严重，而炎症和组织破坏通常在96小时后出现（Güémez和García，2021）。初期表现为高热、严重恶心、呕吐和颈部僵硬，随后出现化脓性脑膜脑炎，最终导致昏迷和死亡（Iyer 等，2024；Haston和Cope，2023）。

福氏耐格里阿米巴的实际发病机制尚未完全阐明。Güémez和García（2021）将阿米巴发病机制大致分为接触依赖性和非接触依赖性机制（Güémez和García，2021）。前者涉及阿米巴对脑组织的侵蚀性侵袭，后者则依赖于分泌蛋白质类生化因子来损伤脑细胞并促进组织破坏（Güémez和García，2021）。发病机制中的炎症成分提示受体-配体相互作用参与其中。先前的研究表明，组织蛋白酶B等抗原在福氏耐格里阿米巴引起的发病机制中发挥作用（Lê 等，2022；Rodríguez-Mera 等，2022）。作为真核生物，福氏耐格里阿米巴可能能够逃避大多数哺乳动物模式识别受体的识别。补体激活曾被认为在福氏耐格里阿米巴发病机制中至关重要；然而，缺乏足够的体内证据，加之福氏耐格里阿米巴对补体介导的溶解具有抗性，排除了这种可能性。

有趣的是，Toll样受体（TLRs）——人类最多样化的模式识别受体（PRRs），能够启动下游信号传导以触发大量炎症细胞因子、趋化因子和干扰素的产生（Uematsu和Akira，2007）——在此似乎发挥着独特的作用。体外实验表明，人类黏膜上皮细胞通过TLR2/TLR4识别福氏耐格里阿米巴滋养体，从而导致促炎细胞因子的产生（Martínez-Castillo 等，2017）。因此，本研究旨在鉴定被认为是PAM中炎症诱导因子的阿米巴抗原，建立炎症发病机制与TLR信号传导之间的关联，并提出一种利用先进的计算方法设计的多表位肽疫苗候选物，作为耐格里虫病的先导治疗药物。

**2. 材料与方法**

**2.1. 初步筛选**

福氏耐格里阿米巴的全部蛋白质组最初从UniProt（https://www.uniprot.org/）获取，数据以".xls"格式保存。蛋白序列经过筛选并以FASTA格式保存以供进一步分析。RCSB蛋白质数据银行（https://www.rcsb.org）同时提供了人细胞表面TLRs（TLR1/2、TLR2/6、TLR4-MD2和TLR5）的结构。

**2.2. 同源建模与结构优化**

利用SWISS-MODEL服务器（https://swissmodel.expasy.org）中的基于模板的相似百分比和最高置信度概念，将蛋白FASTA序列建模为三维结构，并以".pdb"格式获取。结构优化采用GalaxyWEB（https://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE）完成，遵循Gorai等（2022）的方法，并根据MolProbity和Ramachandran评分进行筛选。

**2.3. 抗原性和致敏性鉴定及立体化学质量分析**

抗原性定义了分子在引发疾病发病机制中的重要性。在此，使用VaxiJen（https://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）和AntigenPro（https://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）来预测和验证所筛选福氏耐格里阿米巴蛋白的抗原性，致敏性则通过AllerTOP v.2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）服务器确定。

所筛选福氏耐格里阿米巴抗原的立体化学性质使用SAVES（https://saves.mbi.ucla.edu）进行分析，其各自的溶解度和等电点则使用Protein-Sol网络服务器（https://protein-sol.manchester.ac.uk/）确定。

**2.4. 分子对接**

所筛选福氏耐格里阿米巴抗原与人细胞表面TLRs（TLR1/2、TLR2/6、TLR4-MD2、TLR5）之间结合效率的测定通过分子对接分析完成，初步使用ClusPro 2.0（https://cluspro.org/login.php?redir=/home.php），并通过HADDOCK 2.4（https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/）进行交叉验证。

**2.5. 结合亲和力与Kd值预测**

所得对接复合物的结合亲和力和平衡解离常数（Kd）使用PRODIGY（https://wenmr.science.uu.nl/prodigy/）网络服务器计算。

**2.6. 正常模式分析**

为确定感兴趣的复合物在平衡状态下各种模式中的灵活性，使用名为iMODS（https://imods.iqf.csic.es/）的常用网络服务器进行正常模式分析（NMA），遵循我们之前的报告之一（Das 等，2024；Chakraborty 等，2025）。

**2.7. 分子动力学模拟**

该复合物中参与分子的分子动力学（MDS）模拟采用GROMACS v5.1（GROningen MAchine for Chemical Simulations）（https://www.gromacs.org/）软件包完成，遵循Malarvizhi和Bayry（2025）的方法。该程序涉及将整个系统置于立方体盒子中，采用简单点电荷（SPC）水模型和GROMOS96 53a6力场进行溶剂化（Das 等，2021），随后分别采用NVT（等温等容）进行5000步和NPT（等温等压）进行50000步的5 ns能量最小化和平衡，力收敛目标小于1000 kcal/mol/nm（Das 等，2024）。最后，遵循Das等（2024）的方法进行了100 ns的分子动力学模拟运行。

**2.8. 结合自由能计算**

复合物系统的结合自由能（ΔGbind）计算可确定该复合物的结合强度。在此，ΔGbind采用GROMACS软件包中的GMXPBSA 2.1工具确定（Das 等，2021）。ΔGbind的计算公式为：

ΔGbind = Gcom – (Grec + Glig)

此外，结合自由能通过另一个方程计算，即：

Gbind = ΔH – TΔS

其中，ΔH表示为：ΔH = ΔEMM + ΔGsol，其中ΔEMM表示总气相能量，ΔGsol代表溶剂化能（Das 等，2024；Chakraborty 等，2025）。以下两个公式确定这些参数：

ΔEMM = ΔEinternal + ΔEelectrostatic + ΔEvdw

ΔGsol = ΔGGB + ΔGSA

ΔEinternal、ΔEelectrostatic和ΔEvdw分别代表内部键能、静电能和范德华能。ΔGGB和ΔGSA分别展开为极性和非极性能量（Chakraborty 等，2025）。

**2.9. 对接复合物内构象变化的分析**

确定在模拟系统中，任何复合物内参与分子发生构象变化的程度，对于定义复合物的整体稳定性至关重要。在本案例中，将未结合的TLRs、福氏耐格里阿米巴抗原及其相应复合物的三维结构进行重叠，使用PyMOL（https://pymol.org/2/）进行分析。

**2.10. 预测疫苗构建的线性表位及其抗原性和致敏性**

为构建疫苗候选物，使用ABCPred（http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/）、BCEPred（https://webs.iiitd.edu.in/cgibin/bcepred/bcepred.pl）和BepiPred服务器从组织蛋白酶B的FASTA序列中预测所需的B细胞和T细胞表位，最终选择三重验证所得的共同肽序列。使用NetMHCpan 4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/）和NetMHCIIpan 4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-4.1/）分别从B细胞表位中筛选MHC-I和MHC-II表位。所选表位通过VaxiJen v2.0、AntigenPro（https://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）和Emboss antigenic（https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/antigenic）服务器进行抗原性预测。AllerTOP v2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）和AlgPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/）网络服务器用于确定表位的致敏性，如上文所述，随后通过CSM-Toxin和ToxinPred 3（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred3/）服务器对其进行毒性分析。

**2.11. 疫苗构建**

所有选定的B细胞、MHC-I和MHC-II表位以线性方式排列，通过不同的连接蛋白将其连接，随后在氨基端添加TLR特异性佐剂（特别是TLR激动剂），以增强和延长T细胞和抗体介导的免疫应答。Pam3CSK4（登录号-2Z7X_C）用于TLR1/2异二聚体，50S核糖体蛋白L7/L12（登录号-P9WHE3.1）用于TLR4，细菌鞭毛蛋白（登录号-CAA02137.1）作为TLR5激动剂，Pam2CSK4（登录号3A79_C）用于TLR6作为佐剂。在疫苗构建过程中探索了EAAAK、KK、GPGPG、HEYGAEALERAG、AAY和RVRR连接子，每个疫苗均在其羧基端添加His标签。

**2.12. 分析疫苗抗原性、致敏性、理化性质、毒性及其二级结构预测**

疫苗候选物的抗原性最初使用VaxiJen 2.0和AntigenPro（https://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）进行预测，随后使用AllerTOP v2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）和AlgPred 2（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/）确定和验证疫苗构建体的致敏性。CSM-Toxin（https://biosig.lab.uq.edu.au/csm_toxin/）用于确定构建体的毒性。随后使用ExPASY-ProtParam工具评估一级理化性质，遵循Das等（2024）的方法。PSIPRED 4.0用于预测所构建疫苗序列的二级结构，其中两个前馈神经网络协同工作，第二个网络利用第一个预测的反馈来优化结构。

**2.13. 疫苗三级结构构建及其立体化学性质分析**

使用trRosetta在线服务器渲染疫苗的三级结构，并按照上述方法使用SAVES v6.0的六因子验证方法对其进行验证。

**2.14. 分子对接及生物物理相互作用分析**

为了预测所构建疫苗候选物与选定人体受体之间最佳的配体-受体相互作用，采用ClusPro v2.0（如2.4节所述）进行蛋白质-蛋白质刚性体对接。此外，使用BIOVIA Discovery Studio 2021分析复合物内的生物物理相互作用。

**2.15. 正常模式分析**

所得复合物的构象稳定性使用iMODS（参见2.6节）进行NMA，所得图谱用于描述结构刚性、可变形性、运动动力学等方面。

**2.16. 免疫模拟以预测疫苗诱导的免疫应答**

通过分析疫苗候选物触发免疫细胞（如细胞毒性T细胞和辅助性T细胞、B淋巴细胞、细胞因子和免疫球蛋白）适当应答的能力，来预测其免疫原性和免疫学应答，在很大程度上决定了所构建疫苗在功效方面的可接受性。

本文利用C-ImmSim服务器（https://wwwold.iac.rm.cnr.it/~filippo/projects/c-immsim-online.html）进行免疫模拟分析，设置了三次连续给药，间隔四周，遵循Das等人（2024）和Chakraborty等人（2025）的实验方案。构建体的氨基酸序列被用于三次给药模拟参数设置（每次10 μl体积），分为三个不同时间步骤（0、84和168步，代表约四周的间隔），其中1步代表0.08小时，总模拟时长为1050步。

2.17. N. fowleri组织蛋白酶B作为疫苗候选物的相关性评估

为确保Nf组织蛋白酶B作为疫苗候选物的适用性，利用NCBI-Basic Local Alignment Search Tool（NCBI-BLAST，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的"blastp"对阿米巴组织和蛋白酶B与人类组织蛋白酶B之间的序列同源性进行配对比对，并使用Jalview v2.11.50（https://www.jalview.org/）进行比对可视化。此外，利用Emboss Stretcher服务器（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_stretcher）确定这两条序列之间的定量相似性。随后，将这两条序列连同来自不同物种的其他73种组织蛋白酶B同源物进行多序列比对，使用分子进化遗传学分析（MEGA）v12软件（https://www.megasoftware.net/）的"最大简约"法构建无根系统发育树，遵循Das等人（2021）的方法。

3. 结果

3.1. N. fowleri抗原的筛选、表征与结构预测

由于炎症在原发性阿米巴脑膜脑炎（PAM）的发病机制中起关键作用，我们旨在调查触发疾病发病的N. fowleri抗原的组成。为此，从UniProt检索了整个阿米巴蛋白组数据，并根据既往关于其可能参与N. fowleri发病机制的报告，选取了27种蛋白质进行进一步分析（表S1）。这些蛋白质主要通过使用"表面蛋白"、"宿主-寄生虫相互作用"和数据库中"完整序列"等过滤器进行精确筛选。

随后预测了选定的27条序列的二级结构，并通过基于模板的建模将其构建为相应的三维结构。经过结构优化后，根据良好的MolProbity和Ramachandran评分，从27种蛋白质中选取了19种（表S2）。抗原根据抗原性和致敏性进一步筛选（表S2），最终得到9种选择（图S1和S2），随后对其立体化学性质进行了分析。这些分析显示所有选择物均为立体化学稳定的，具有可接受的ERRAT、Ramachandran和Verify3D评分（图S3、S4、S5和表S3）。N. fowleri抗原溶解度预测显示组织蛋白酶B、半胱氨酸蛋白酶和Mp2CL5具有低溶解度；核糖体蛋白S3、血红蛋白样蛋白和热休克蛋白SSE1具有中等溶解度；GOSR2、NPSN11和哺乳动物硫氧还蛋白同源物具有高溶解度（图S6、S7和表S3）。

3.2. 追踪N. fowleri抗原与TLR之间的潜在相互作用

通过分子对接及双重验证，对筛选出的抗原作为人类细胞表面TLR（TLR1/2、TLR2/6、TLR4和TLR5）配体的潜力进行了评估，获得了多个具有不同结合亲和力的对接复合物。具体而言，四种抗原——组织蛋白酶B（图1A-C）、GOSR2、Mp2CL5和硫氧还蛋白同源物被发现在与所有四种目标TLR结合（表S4），从而为推进相关对接复合物（共16个）提供了依据。使用PRODIGY的进一步探索有助于筛选流程，该步骤显示组织蛋白酶B是与TLR1/2异二聚体相互作用最强的抗原（表S5），基于其最高结合亲和力评分（?16.1）和最低解离常数（Kd值= 1.5e?12）。生物物理分析进一步显示组织蛋白酶B-TLR1/2复合物具有强稳定性，由15个氢键、6个疏水相互作用和5个静电键支持（图1D-E和表S6）。显著相互作用（主要是氢键和疏水相互作用）已在图S8中以线性示意图形式呈现，以进一步清晰说明。

图1. 组织蛋白酶B与各种细胞表面TLR的分子对接分析。A，组织蛋白酶B与所有四种选定的TLR（即TLR1/2、TLR2/6、TLR4和TLR5）相互作用。B，组织蛋白酶B与(i) TLR1/2、(ii) TLR2/6、(iii) TLR4和(iv) TLR5的不同结合拓扑结构。C，上述复合物中获得的对接评分、结合亲和力和解离程度的表格数据。D，展示折叠构象的组织蛋白酶B-TLR1/2复合物带状结构图。E，组织蛋白酶B-TLR1/2复合物内部残基相互作用，描述氢键和疏水相互作用的形成与分布，以各自的颜色代码表示。F，组织蛋白酶B与人类TLR1/2之间生物物理相互作用的表格数据。（关于图中颜色的参考说明，请读者参阅本文的Web版本。）

3.3. 组织蛋白酶B与TLR1/2异二聚体结合形成热力学稳定的复合物

以下分析提供了支持组织蛋白酶B-TLR1/2结合稳定性的初步证据。为评估复合物内集体原子运动和振动——这有助于了解整体结构域运动和复合物柔性——进行了正常模式分析（NMA）。NMA模拟平衡状态下功能运动，预测蛋白质或蛋白质-蛋白质复合物可能达到的柔性构象数量（Chakraborty等人，2025）。

此处使用iMODS服务器进行调查，该服务器提供了相关参数的图形表示（图2）。"仿射箭头"功能生成的红色和青色箭头描绘了参与分子在TLR1/2-组织蛋白酶B复合物可靠结构域动力学中的运动方向（图2A）。协方差图进一步支持了这一预测，该图定义了复合物内的相关（红色）、不相关（白色）和反相关（蓝色）残基运动。我们观察到相关运动在TLR1/2-组织蛋白酶B复合物中最为丰富（图2B）。此外，弹性网络矩阵显示灰色圆点数量稀疏，表明TLR1/2-组织蛋白酶B复合物具有明确的运动柔性，因为EN图中的每个圆点代表连接两个原子的一个弹簧（图2C）。

图2. 通过正常模式分析（NMA）模拟对组织蛋白酶B-TLR1/2复合物稳定性和结构域动力学的初步分析，在20个分析模式内描绘了组织蛋白酶B-TLR1/2复合物的稳定性、结构域运动和柔性。A，仿射箭头模型显示组织蛋白酶B-TLR1/2复合物内参与分子的运动方向。B，协方差图显示复合物内的形变、原子和残基波动。C，弹性网络矩阵。D，B因子图和E，可变形性图验证复合物具有可接受的稳定性和柔性。F，本征值图显示解离组织蛋白酶B-TLR1/2复合物所需能量超过1，表明复合物表观稳定。G，方差图，其中蓝色代表个体方差，青色代表累积方差。（关于图中颜色的参考说明，请读者参阅本文的Web版本。）

通过B因子和可变形性图研究了该复合物内原子位移的相对程度（图2D和E），观察到中等程度的分散。此外，组织蛋白酶B-TLR1/2复合物计算得出的本征值为1.134668e?05（图2F），表明需要中等量能量使复合物变形，因为本征值反映单个原子或残基形变对蛋白质总运动的贡献。有趣的是，方差图（图2G）测量计数模式内的波动百分比，估计在前7个模式（共20个）中达到了80%的方差，进一步验证了组织蛋白酶B-TLR1/2的可接受稳定性。

后续分子动力学模拟分析进一步增强了NMA输出结果的可靠性（图3）。均方根偏差（RMSD）代表100 ns模拟设置中的相对构象稳定性，在后期阶段稳定，初始轻微波动后偏差未超过0.8 nm（图3A）。均方根波动（RMSF）图（图3B）也得出类似结论，显示模拟早期阶段存在中等氨基酸水平波动，最终阶段消退，表明复合物兼具柔性和稳定性，由螺旋和折叠构象的存在支持。重要的是，平均RMSF值波动未超过0.1至1 nm。图3C以质量加权均方根距离的形式说明了蛋白质复合物的紧密性，即从一组原子的共同质心到各原子的距离，也称为回转半径（Rg）。组织蛋白酶B-TLR1/2复合物获得的Rg图在4.2至4.4 nm范围内保持稳定（图3C），再次说明其结构稳定性。复合物在整个模拟时间内的溶剂可及表面积（SASA）值在610-660 nm2范围内波动，表明波动较小（图3D）。

图3. 分子动力学模拟实验证明组织蛋白酶B能有效与TLR1/2结合形成热力学稳定的复合物。A，均方根偏差（RMSD）图，B，均方根波动（RMSF）图，C，回转半径（Rg）图，D，溶剂可及表面积（SASA）图，E，模拟设置100 ns时间范围内组织蛋白酶B自身及TLR1/2同时发生的构象变化证据。(i) TLR1/2结合组织蛋白酶B（0 ns），(ii) TLR1/2结合组织蛋白酶B（100 ns），(iii) (i)和(ii)的叠加图像。

为强化这一推测，通过叠加（图3E(i)）模拟后（100 ns）的复合物结构（图3E(ii)）与其初始结构（0 ns）（图3E(iii)）进行对比分析，研究组织蛋白酶B-TLR1/2复合物因结合而产生的构象改变。两种构象之间的可见差异支持了组织蛋白酶B作为潜在TLR1/2配体的潜力，因为配体诱导的受体构象变化是蛋白质-蛋白质相互作用最有力的计算机模拟指标之一。

3.4. 组织蛋白酶B的物理化学特性

使用ProtParam服务器计算了组织蛋白酶B的物理化学特性，如分子量、脂肪指数和疏水性总平均值（GRAVY）评分（表S7）。GRAVY（疏水性总平均值）为蛋白质/多肽序列中所有组成氨基酸疏水性的平均值之和，显然，较高的评分表示更大的疏水性，较低的评分表示更强的亲水性。该服务器报告组织蛋白酶B为345个氨基酸的蛋白质，分子量为38.38 kDa，不稳定性指数为34.47，表明其为稳定的，GRAVY评分为?0.149（表S7）。

3.5. 从组织蛋白酶B预测表位及其抗原性验证

通过BepiPred 2.0、ABCPred和BCEPred筛选B细胞表位，通过NetMHCpan和NetMHCIIpan分别筛选MHC-I和MHC-II表位，随后进行抗原性、致敏性和毒性分析，共确定了10个B细胞表位、5个MHC-I表位和9个MHC-II表位，用于疫苗候选物的构建。选定的表位总结于表S8和S9中。

3.6. 疫苗候选物的构建及其二级结构预测

首先使用B细胞、MHC-I和MHC-II表位设计疫苗的基础构建体（图4A），随后复制为四个独立的疫苗候选物，每个分别偶联不同的TLR佐剂。这些构建体命名为疫苗1（针对TLR1/2）、疫苗2（针对TLR2/6）、疫苗3（针对TLR4）和疫苗4（针对TLR5）（图4B）。使用PSIPRED进行的二级结构预测揭示了疫苗构建体中特定的随机线圈、折叠和α-螺旋区域（图S9A）。

图4. 设计有效的针对阿米巴病的疫苗。A，疫苗构建体的示意图，通过将MHC-I和MHC-II表位使用连接蛋白连接，并安装人类细胞表面TLR特异性佐剂制备。B，(i) 疫苗1（含TLR1/2特异性佐剂）、(ii) 疫苗2（含TLR2/6特异性佐剂）、(iii) 疫苗3（含TLR4特异性佐剂）和(iv) 疫苗4（含TLR5特异性佐剂）的三级结构。C，(i) 疫苗1-TLR1/2复合物、(ii) 疫苗2-TLR2/6复合物、(iii) 疫苗3-TLR4复合物和(iv) 疫苗4-TLR5复合物的三维结构。D和E，疫苗3-TLR4复合物内可见的生物物理相互作用（以非共价蛋白质-蛋白质相互作用形式）。

3.7.

# 疫苗构建体的理化表征及抗原性与致敏性评估

表S10汇总了ProtParam预测的四种疫苗构建体的比较理化特性，表S11分别汇编了抗原性、致敏性和毒性的可靠数值与预测结果。

## 3.8. 三级结构的构建及其立体化学性质的验证

疫苗构建体的最终三级结构由trRosetta生成（图4B），经SAVES v6.0立体化学验证，仅疫苗3被确认为立体化学可接受的（图S9B），依据包括ERRAT图、Ramachandran图和Verify3D图。疫苗3的整体ERRAT质量因子值为96.850（图S9B(i)），Ramachandran评分优异，显示94.4%的残基位于最偏好区域（图S8B(ii)），并经Verify3D图进一步验证（图S9B(iii)）。

## 3.9. 分子对接及生物物理相互作用分析表明疫苗3具有高效的结合潜力

在此研究中，使用ClusPro v2.0对四种疫苗与各自的细胞表面TLR（TLR1/2、TLR2/6、TLR4和TLR5）进行分子对接分析，以评估它们之间可能的配体-受体相互作用。结果表明，与其余疫苗相比，疫苗3与TLR4的结合效率最高（图4C和D），这归因于丰富的氢键和疏水相互作用。

## 3.10. 疫苗3与TLR4形成稳定复合物

在NMA分析（图S10）中，疫苗3-TLR4复合物表现出优异的稳定性，由特征箭头函数所指示的构象动态变化可证实（图S10A）。该复合物表现出丰富的内部相关运动（图S10B），弹性网络图中稀疏分散的灰色圆点（图S10C）进一步验证了该复合物的柔韧性。B因子和可变形性图（图S10D和E）确认了复合物在各模式下的整体稳定性，仅在1400-1600残基范围内观察到轻微波动。此外，疫苗3-TLR4复合物的本征值评分为3.110338e?07，表明需要相当大的能量才能使复合物解离，再次证实其稳定性（图S10F）。此外，该复合物在二十个分析模式中的前三个模式内达到了80%的方差（图S10G），证实了疫苗3-TLR4复合物的稳定构象。疫苗3与TLR4相互作用的详细列表，主要涉及氢键和疏水相互作用，已在图S13中以线性图示形式呈现，以进一步阐明细节。

## 3.11. 疫苗3能有效激发初级和次级免疫反应

免疫模拟是基于以下原理开展的：有效疫苗预计应能产生抗体、提供长期免疫保护和病原体清除能力，并启动强烈的保护性细胞反应。在此研究中，C-IMMSIM服务器用于检测疫苗候选物在B细胞激活、克隆扩增和分化、抗原清除以及免疫反应从初级向次级转变方面的潜力。该服务器还可可靠地预测产生主动免疫所需的T细胞动态变化，并追踪疫苗所引发的关键信号分子的表达水平。该服务器还允许用户定义特定的剂量间隔，从而采用更现实的方法，因为疫苗理想情况下应在最优时间间隔内以多剂形式给药，以产生有效反应和免疫记忆。在此研究中，疫苗3显示具有在宿主中产生稳健且适当免疫反应的潜力。次级免疫反应的生成被加速。针对疫苗候选物的初级反应表现为Th1细胞因子水平升高（IFN-γ、IL-2）（图5A）和IgM高水平（图5B）。B细胞群体在次级和三级反应中显著增加，由IgG1 + IgG2、IgM和IgG + IgM水平升高所指示（图5B和C）。辅助性T细胞群体也增加了（图5D），细胞毒性T细胞亦然（图5E）。这些结果与实验观察到的与疫苗介导保护相关的免疫反应基本一致，共同表明所选疫苗候选物具有抗PAM的潜力（Rojas-Hernández et al., 2004, 2014, 2020; Mendoza-Ceballos et al., 2023; Carrasco-Yepez et al., 2010; Moseman, 2020）。

**图5. 疫苗3引发的预测免疫反应的图形化表示。** A，丰富的IFN-γ反应。B，系统暴露于疫苗后的免疫球蛋白反应。C、D和E，持续超过300天的活跃和记忆B细胞及T细胞反应。预测的免疫模拟在计算机上使用C-ImmSim在线服务器（https://wwwold.iac.rm.cnr.it/～filippo/projects/c-immsim-online.html）进行。

## 3.12. N. fowleri组织蛋白酶B作为疫苗候选物的相关性评估

Nf组织蛋白酶B与其人类同源物在蛋白质水平的比较成对比对显示，这两个序列之间存在显著的不相似程度（图S11A）。使用NCBI-BLAST进行序列同源性搜索显示一致性百分比值为40%（图S11A），而Emboss Stretcher计算的一致百分比为37%（图S11B）。比较保守百分比和共识区域已在Jalview中可视化（图S11C）。此外，使用MEGA v12构建的无根系统发育树显示，Nf组织蛋白酶B与爱德华氏象鼩（Elephantulus edwardii）具有最接近的同源性（图S12）。人类和Nf组织蛋白酶B同源物共享一个单系群，自展节点值为11（图S12）。

## 4. 讨论

Naegleriasis的高死亡率及其近期重新流行（Ahmad Zamzuri et al., 2023; Fowler and Carter, 1965; Gharpure et al., 2021; CDC, 2025a; Güémez and García, 2021; Nadeem et al., 2023; Joseph et al., 2022; Iyer et al., 2024; Desai et al., 2025; Haston and Cope, 2023; CDC, 2025b）为本研究提供了强有力的动力。既往报告与近期研究均表明，N. fowleri引起强烈的炎症性病理过程，通过TLR2或TLR4依赖性信号通路触发细胞因子产生以及中性粒细胞和巨噬细胞募集等免疫事件，而病原体入侵的早期阶段基本无炎症表现（Cervantes-Sandoval et al., 2008）。

N. fowleri滋养体通过激活小胶质细胞引起显性炎症和细胞因子产生，具体来说，小胶质细胞TLR与组织损伤所产生的阿米巴病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）发生相互作用。该病原体被认为利用半胱氨酸蛋白酶入侵血脑屏障（BBB），同时组织损伤也吸引免疫细胞（Güémez and García, 2021）。此外，脑血管内皮细胞的TLR4也被发现能引发多种白细胞黏附分子的产生，如血管细胞黏附分子1（VCAM-1）和细胞间黏附分子1（ICAM-1），这些分子进而刺激大量炎症细胞进入中枢神经系统（Güémez and García, 2021）。

考虑到N. fowleri的接触非依赖性发病机制，一种名为组织蛋白酶B的半胱氨酸蛋白酶引起特别关注。其作用已在TLR4介导的疾病表现中多次被记载（Martínez-Castillo et al., 2017; González and Pacheco, 2014; Zao et al., 2023）。有趣的是，来自其他病原体的组织蛋白酶B抗原在实验验证的研究中已被特别描述为与多种人类免疫受体相互作用，但大多为接触依赖性机制。例如，旋毛虫（Trichinella spiralis）的组织蛋白酶B参与与宿主I型胶原蛋白的接触依赖性结合，后者充当与细胞附着力和侵袭相关的结构细胞表面受体（Almeida et al., 2001）。蠕虫已被发现拥有组织蛋白酶B，以接触依赖性方式与宿主PBMCs相互作用，最终诱发显著的促炎表现（Eisa et al., 2021; Gonzalez-Leal et al., 2014）。此外，主要利什曼原虫（Leishmania major）等病原体中组织蛋白酶B的存在直接决定宿主MHC-II分子的表达和配体结合潜力（Rodríguez-Mera et al., 2024）。

聚焦于Naegleriasis，Castillo等人（Martínez-Castillo et al., 2017）证明TNF-α在Naegleriasis中通过间接刺激中性粒细胞反应，同时通过阿米巴PAMPS触发TLR4依赖性β防御素-2和其他促炎细胞因子的产生。使用BV-2小胶质细胞进行的体外研究表明，N. fowleri重组组织蛋白酶B能触发TLR2、TLR4和MyD88的表达，并诱导多种促炎分子的产生，包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和iNOS，以及NF-κB家族p65（RelA）的磷酸化及其核转位。抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs，如JNK、p38和ERK）和转录因子（如NF-κB和AP-1）可有效抑制这些促炎细胞因子的产生（Lê et al., 2022）。组织蛋白酶B还被报道在阿米巴病理过程中发挥重要作用，原因在于其在代谢、营养摄取、宿主组织侵袭和免疫逃逸中的作用（Rodríguez-Mera et al., 2022）。实验性技术如蛋白质组学分析和抗体识别试验已证明，组织蛋白酶B被N. fowleri滋养体形式包装到细胞外囊泡和外泌体中，有助于抗原向细胞外介质的转运，随后这些囊泡被宿主中枢神经系统内化（Lee et al., 2011）。

受PAM重新流行的启发，本研究旨在解决三个关键问题。第一个目标是确定组织蛋白酶B是否是N. fowleri中唯一参与神经炎症病理过程的PAMP，还是有其他配体共同贡献。因此，通过UniProt探索了N. fowleri的整个蛋白质组，数据库中描述为在阿米巴侵袭和致病进展中具有功能的27种蛋白质序列（表S1）在预测其二级结构（图S1）后成功建模为三级（3D）结构（图S2）。经过结构优化，选择了19种蛋白质（表S2），其预测的抗原性和致敏性最终产生了9种有前途的抗原用于进一步研究（表S2），其中根据SAVES报告，所有抗原均被发现在立体化学上稳定（图S3、S4、S5和表S3）。这些选定的N. fowleri的9种抗原表现出不同的溶解度特征（图S6和S7以及表S3）。

上述9种蛋白质的分子对接研究揭示，四种抗原——组织蛋白酶B、GOSR2、Mp2CL5和硫氧还蛋白同源物——与所有四种人类细胞表面TLR（TLR1/2、TLR2/6、TLR4和TLR5）相互作用（图1A–C，表S4）。其中，组织蛋白酶B-TLR1/2显示出最强的配体-受体相互作用（表S5）。介导该相互作用的关键残基通过BIOVIA Discovery Studio进行了研究，发现丰富的氢键和疏水相互作用在稳定复合物中发挥了重要作用（图1D–E和表S6），暗示阿米巴组织蛋白酶B可作为潜在的TLR1/2配体。本研究通过所提供的计算证据表明存在接触依赖性结合倾向，其中N. fowleri组织蛋白酶B的特异性表面残基与宿主TLR1/2外结构域之间存在直接的物理相互作用。已有的实验证据可能支持这一发现，因为相关研究突出了重组抗原作为外源性刺激物的活性，在小胶质细胞中触发TLR2和TLR4信号传导，最终促进MyD88和MAPK的活跃（Chen et al., 2013）。

组织蛋白酶B-TLR1/2复合物的NMA分析揭示，在六个不同参数上表现出柔韧性和结构域移动性（图2）。这些数据得到了后续分子动力学模拟研究和结构与构象稳定性分析的证实。所有这些证据强化了这样一个假说：组织蛋白酶B可以通过与TLR1/2异二聚体相互作用来诱发促炎免疫反应。

基于这些见解，本研究使用组织蛋白酶B氨基酸序列中最具抗原性的区域或"表位"设计了多表位疫苗（图4A–表S8和S9），并评估了所选表位的抗原性、致敏性和毒性。已知短表位疫苗构建体本身往往免疫原性较弱。佐剂的使用可显著增强其免疫原性，通过上调抗原呈递细胞的激活相关分子，并提高T细胞和B细胞反应。将连接蛋白和TLR特异性佐剂纳入多表位构建体中，为每个靶标TLR生成了单独的候选物（图4A–表S8和S9）。EAAAK连接肽在佐剂和核心构建体之间提供刚性的螺旋间隔，以增强蛋白质稳定性和免疫原性。同时，KK间隔序列连接B细胞表位，同时防止形成接合新表位；富含甘氨酸的GPGPG序列连接辅助性T细胞表位，以增强结构灵活性和溶解性。HEYGAEALERAG等专用序列优化了蛋白酶体和溶酶体降解，以实现高效的抗原加工，辅以AAY连接肽确保细胞毒性T淋巴细胞表位之间的精确切割。

最后，蛋白酶敏感的RVRR连接肽将组氨酸标签连接到核心区域，同时进一步支持表位的有效加工、稳定性和柔性（Lennon-Duménil等，2002；Chichili等，2013；Athanasiou等，2017；Jha等，2023）。对所有四种疫苗构建体的理化性质（表S10）以及抗原性和致敏性（表S11）进行了分析。每个构建体均与其相关的Toll样受体（TLRs）进行了分子对接相互作用分析，最初命名为疫苗3的TLR4特异性疫苗候选物与TLR4形成了热力学最稳定的复合物，并通过NMA实验进一步验证了这一结果。疫苗3的免疫应答谱（图5）在多项特征上与实验证据的结果进行了比较，显示出其激发针对PAM的保护性应答的潜力。疫苗3可诱发强烈的IgG和IgM应答，促进记忆B细胞的长期维持，并在三次给药后触发IFN-γ的表达。多项体内研究，包括小鼠模型免疫接种实验，均报道了IgG和IgM应答增强以及IFN-γ水平升高与增强抗PAM保护作用之间的关联（Rojas-Hernández等，2004、2014、2020；Mendoza-Ceballos等，2023；Carrasco-Yepez等，2010；Moseman，2020）。然而，仍需进一步的实验证据来验证这些发现。此外，Nf组织蛋白酶B的氨基酸序列与其人类同源蛋白存在显著差异，这再次支持了该蛋白作为治疗人类PAM的疫苗候选物的应用潜力。所提出的疫苗构建体的编码序列预计可用于大量生产重组肽疫苗，该疫苗可高效储存为冻干粉、冷冻状态（超低温状态）或以液体形式保存在小瓶或预充针中。重组疫苗需在不同缓冲液中以及佐剂存在条件下的稳定性进行检测。特别地，该疫苗中溶剂和佐剂的选择需要仔细的实验优化。任何疫苗的效力都取决于其给药途径[45]，这方面也需要进一步研究。尤其是给药后的研究应重点关注中和抗体效价以及效应细胞数量，以减轻PAM。

5. 结论

全球范围内儿童和青少年PAM发病率的不断上升构成了严重威胁。治疗选择匮乏以及/或现有治疗方法的疗效不足，使得亟需开发新的策略来应对福纳贾利虫感染。在此背景下，本计算机模拟研究聚焦于组织蛋白酶B——一种关键的原虫抗原，其作为可信的人类PAMP发挥作用——并探索其作为计算设计高效多表位肽疫苗治疗靶点的潜力。所设计的疫苗似乎能有效激发所需的抗体、T细胞及细胞因子应答，且不引发过敏反应。所有发现均需在适当疾病模型中进行实验验证，并通过临床前试验进一步研究。

贡献声明
Ankita Chakraborty：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，调查研究，正式分析，数据整理。Giridharan Loghanathan Malarvizhi：撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，调查研究，正式分析。Debapriya Dutta：撰写——审阅与编辑，方法学，调查研究，数据整理。Pritha Chakraborty：方法学，调查研究。Jagadeesh Bayry：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，指导，软件，资源，正式分析。Suprabhat Mukherjee：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，指导，资源，正式分析，概念化。

Ankita Chakraborty | Giridharan Loghanathan Malarvizhi | Debapriya Dutta | Pritha Chakraborty | Jagadeesh Bayry | Suprabhat Mukherjee