引言
核黄素是人体和动物生长所需的微量营养素之一，在体内以黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的活性形式作为辅酶，促进新陈代谢或参与细胞内的多种氧化反应（Saedisomeolia & Ashoori, 2018）。与大多数植物和微生物不同，脊椎动物无法自行合成这种营养素，必须通过饮食获得（Vitreschak, Rodionov, Mironov, & Gelfand, 2002）。当人体摄入的核黄素量低于0.3毫克/天时，容易导致结膜炎、脂溢性皮炎、白内障、心血管疾病等（Brabin & Coulter, 2009; McNulty, Pentieva, & Ward, 2023; Sinha et al., 2022）。核黄素广泛应用于功能性食品、饮料、制药和饲料行业，其年需求量不断增加，因此研究和开发更有效的合成方法至关重要（T. Y. Lee et al., 2023; H. Li, Krall, Frankenfeld, & Slavin, 2023; You et al., 2021）。
在核黄素工业生产的早期阶段，化学合成和半合成方法是主要的生产方式。然而，由于反应过程中会产生重金属和有毒化合物，这些方法逐渐被生物发酵所取代（Revuelta et al., 2017）。微生物发酵因其原材料成本低廉、生产过程简单且无污染而受到青睐。经过人工筛选的野生核黄素生产菌株（如Clostridium acetobutylicum和Ashbya gossypii）由于产率低和发酵周期长，在发酵生产中并未取得显著优势（Revuelta et al., 2017; J.-R. Zhang et al., 2022）。幸运的是，随着基因工程技术的进步，诸如突变选择、强启动子替换、基因敲除和异源表达等代谢工程策略被应用于工业菌株的设计中，显著提高了核黄素的产量。例如，重组Bacillus subtilis菌株RF1-pMA5-sat-zwf在60小时的中试发酵中产生了12.01克/升的核黄素产量（Cheng et al., 2015）；Bacillus sp. CJKB0001菌株经过3天的发酵后，核黄素产量达到26.8克/升（Lee Kwang et al., 2003）。此外，Lactobacillus和酵母Candida flareri等细菌和真菌也被用于核黄素的生产研究。增强前体供应和优化核黄素操纵子已成为改造核黄素生产菌株的主要方法（Thakur, Tomar, Brahma, & De, 2016; Yatsyshyn, Fedorovych, & Sibirny, 2014; J.-R. Zhang et al., 2022）。
微生物中的核黄素合成途径已经被彻底阐明。葡萄糖进入细胞后，首先通过糖酵解（EMP）途径、三羧酸（TCA）循环、戊糖磷酸途径和嘌呤途径转化为核酮糖-5-磷酸（RU-5P）和鸟苷三磷酸（GTP）。这些代谢物随后作为核黄素合成途径的底物，在一系列5-6步的酶促反应中最终生成核黄素（Fu et al., 2022）。据报道，通过增强参与核黄素合成途径的基因表达、过表达嘌呤合成途径以及调节能量代谢等方法，工程菌株（如B. subtilis和Corynebacterium ammoniagenes）的核黄素产量显著提高（Revuelta et al., 2017）。例如，当使用强启动子PAgGPD共过表达核黄素合成途径基因RIB1、RIB2、RIB3、RIB5和RIB7时，Aspergillus oryzae的核黄素产量是野生型的5.4倍（Ledesma-Amaro, Serrano-Amatriain, Jiménez, & Revuelta, 2015）。通过对B. subtilis RH33进行fed-batch发酵，并通过组成型P43启动子过量表达gapB（编码NADPH依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和fbp（编码果糖-1,6-二磷酸酶）基因，核黄素产量增加了27.8%（Y. Duan, Chen, Chen, Jingyu, & Zhao, 2010）。目前，B. subtilis因其良好的发酵性能和成熟的工业应用而成为核黄素生物合成的常用工程菌株。然而，菌株优化可能会受到质粒稳定性和相互连接的代谢途径调控等因素的影响（Perkins et al., 1999）。先前的代谢建模估计，在葡萄糖受限条件下，B. subtilis的理论核黄素产量约为0.16摩尔/摩尔葡萄糖（大约0.335克/克葡萄糖），而实验实际获得的葡萄糖到核黄素的转化率通常低于这一理论值（Sauer, Cameron, & Bailey, 1998）。这些观察表明，有效协调前体供应和下游核黄素合成仍是一个重要的工程挑战。
大肠杆菌是一种在生物学研究中非常重要的底盘细菌，生长迅速，具有明确的基因组特征，长期以来一直被用于生产氨基酸、生物燃料和可降解塑料等天然产物（Y. Lee et al., 2024; C. Wang, Pfleger, & Kim, 2017; L. Wang et al., 2023）。它是一种具有巨大工业生产潜力的宿主细菌。在之前的研究中，将拟南芥中的维生素C合成途径的十个基因表达在大肠杆菌中，摇瓶培养产物中含有1.53毫克/升的维生素C，实现了维生素C的从头合成（Tian et al., 2022）。从两个菌株中引入了六个基因到大肠杆菌中，成功构建了一种生产terrequinone A的工程菌株，通过L-色氨酸和预醇的发酵获得了106.3毫克/升的terrequinone A（L. Wang et al., 2023）。经过代谢工程和合成生物学改造的大肠杆菌具有完全表达外源代谢途径的潜力。在大肠杆菌中建立独立的核黄素合成途径是一个有吸引力的设计方向。B. subtilis的核黄素合成途径涉及26个功能基因，这些基因在大肠杆菌中的成功异源表达是一个重要的研究课题（Shi, Shen, Chen, Chen, & Zhao, 2009）。在这项研究中，我们利用实验室先前建立的基于PCR的精确合成（PAS）技术在大肠杆菌中实现了核黄素的从头合成（Xiong et al., 2006）。这些核黄素合成途径的26个基因被分为四个功能模块：RU-5P合成、肌苷一磷酸（IMP）合成、GTP合成和核黄素调控因子。这些功能模块被引入大肠杆菌并进行了适当表达，优化了发酵条件，最终在fed-batch发酵48小时后，该菌株的核黄素产量达到了651.94毫克/升。尽管这个产量低于以往报道的水平，但这项研究提供了一种新的核黄素生产策略和方法。
