蓝莓黄酮醇3-羟化酶在二氢山柰酚生物合成中的功能表达及其底物相互作用机制

《Food Bioscience》：Functional Expression and Substrate Interaction Mechanism of Blueberry Flavanone 3-Hydroxylase in Dihydrokaempferol Biosynthesis

　　

• •
  从蓝莓中提取的黄酮醇3-羟化酶VcF3H在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行了异源表达
• •
  该重组菌株能催化柑橘苷元的羟基化反应，生成二氢山柰酚
• •
  通过优化全细胞生物转化技术，DHK的产量提高到了36.35毫克/升，转化率达到了72.71%，产量提升了1.72倍
• •
  多光谱分析和分子模拟揭示了VcF3H与柑橘苷元之间的相互作用机制

引言

二氢山柰酚（DHK）是一种典型的黄酮类化合物，在多种植物中广泛存在，例如蓝莓、柑橘类水果和松树皮（Chen等人，2024年）。DHK具有特征性的黄酮骨架结构，其中含有多个羟基和酮基官能团。这些结构特征使其具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤和心血管保护作用（Huang等人，2023年；Shan等人，2019年；Zhang等人，2021年）。因此，DHK在营养补充、疾病预防和治疗开发方面具有很大的应用潜力。DHK也是黄酮类化合物生物合成途径中的重要中间体。它通过特定酶的催化作用从柑橘苷元生成，并可进一步被多种酶修饰，生成结构多样的黄酮类衍生物，包括花青素。其分子结构中的羟基和酮基为酶促修饰提供了多个反应位点（Ma等人，2023年）。由于其生物活性以及作为黄酮类生物合成关键前体的作用，市场对DHK的需求显著增加。目前，DHK主要通过从植物材料中直接提取获得。然而，植物中天然存在的DHK量通常较低，且提取效率受原材料来源、季节、品种和提取方法等因素的限制。相比之下，化学合成可以在一定程度上提高DHK的生产效率，但它通常存在一些局限性，如反应步骤复杂、环境问题以及可持续性不足（Banafi等人，2023年；Huang等人，2025年）。因此，基于合成生物学和代谢工程的异源生物合成策略为DHK的绿色生产提供了一种有前景的方法。通过构建微生物细胞工厂，可能实现可控、高效和可持续的DHK生产（An等人，2023年；Qiu等人，2025年）。在这种情况下，选择能够高效催化柑橘苷元转化为DHK的特定酶，并阐明它们与底物的相互作用机制，对于建立一个高效的DHK生物合成系统至关重要。

黄酮醇3-羟化酶（F3H）是黄酮类生物合成中的关键酶，它特异性地催化柑橘苷元的C-3位羟基化反应，生成二氢山柰酚（DHK）（Liao等人，2026年；Ma等人，2023年）。F3H通常被归类为2-氧代谷氨酸依赖性双加氧酶超家族的成员，其催化反应依赖于α-酮戊二酸、Fe²⁺和分子氧。作为连接上游柑橘苷元与下游黄酮醇和花青素生物合成的关键代谢节点，F3H通过其表达水平和催化效率直接影响DHK及相关黄酮类产物的生物合成能力（Wu等人，2023年）。已经研究了来自多个植物物种（包括金鱼草、玉米、拟南芥和柑橘）的F3H，这些研究表明F3H在不同植物中高度保守（Shen等人，2006年）。此外，F3H在花朵着色、黄酮类代谢调控以及非生物胁迫响应中发挥着重要作用（Jiang等人，2013年；Sui等人，2023年）。然而，来自不同植物来源的F3H在催化性能和底物结合特性上可能存在差异，从而影响DHK的生物合成效率。

蓝莓富含多种黄酮类化合物，尤其是花青素，因此是研究黄酮类代谢途径的重要植物资源（Routray & Orsat，2011年）。DHK是花青素和其他黄酮类衍生物生物合成的关键前体，其生成主要依赖于F3H催化的柑橘苷元转化。因此，从蓝莓中提取的F3H可能在蓝莓中的黄酮积累中发挥重要作用，并且也可以作为异源DHK生物合成的关键酶来源。以往关于蓝莓F3H的研究主要集中在其表达及其在黄酮类和花青素积累中的功能作用（Zhang等人，2017年；Chung等人，2019年）。尽管已在多个植物物种中研究了F3H的功能，但整合蓝莓来源F3H的异源功能表达、优化其全细胞生物转化性能以及分析其与柑橘苷元的相互作用的研究仍较为有限。此类信息对于评估其在DHK生物合成中的潜在应用及其底物识别行为非常重要。

因此，在本研究中，构建了一个用于蓝莓来源黄酮醇3-羟化酶（VcF3H）的大肠杆菌异源表达系统，以验证其催化柑橘苷元转化为二氢山柰酚（DHK）的能力。进一步优化了该重组菌株的全细胞生物转化条件。此外，结合光谱表征、分子对接和分子动力学模拟，研究了VcF3H与柑橘苷元之间的相互作用，并确定了参与底物结合的潜在残基。本研究旨在阐明VcF3H在DHK生物合成中的功能及其底物识别特性，为DHK的绿色生物制造及后续的F3H理性工程提供了理论依据。

章节片段

化学物质和菌株

大肠杆菌 BL21(DE3)购自辽宁京研生物科技有限公司（沈阳，中国）。LB肉汤和LB琼脂培养基购自青岛Hope生物科技有限公司（青岛，中国）。柑橘苷元标准品、二氢山柰酚标准品和异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自上海宇然生物科技有限公司（上海，中国）。苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液、细菌裂解缓冲液和溶菌酶购自北京Solarbio

VcF3H的序列表征和重组表达验证

从NCBI数据库中检索到了编码蓝莓来源黄酮醇3-羟化酶（VcF3H；GenBank登录号MH321462.1）的基因序列。该VcF3H核苷酸序列长度为1138 bp，其编码区编码了一个由366个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量为约40.5 kDa。多重序列比对显示VcF3H与来自柑橘、玉米、欧芹和其他植物物种的F3H具有高度相似性

结论

本研究在大肠杆菌 BL21(DE3)中构建了一个用于蓝莓来源黄酮醇3-羟化酶VcF3H的异源表达系统，并通过使用 authentic DHK 标准品进行HPLC分析，验证了其催化柑橘苷元转化为二氢山柰酚（DHK）的能力。VcF3H表现出2-氧代谷氨酸依赖性双加氧酶的保守结构特征，支持其作为F3H的功能定位。基于对全细胞的单因素筛选

CRediT 作者贡献声明

高彬赫：撰写——原始稿件、可视化、验证、软件、资源、方法学、研究、数据分析、数据管理

数据可用性

数据可应要求提供。

作者声明他们没有任何已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

本项目得到了中国国家重点研发计划（2024YFD1600605）的支持。

高彬赫|季冠宇|王月华|舒驰|李斌|孟贤军|孙喜云