Temporin-GHa11R 通过抗菌效力和巨噬细胞极化调控加速 MRSA 感染伤口愈合

《International Immunopharmacology》：Temporin-GHa11R accelerates MRSA-infected wound healing via antibacterial efficacy and regulation of macrophage polarization

　　

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  GHa11R表现出有效的抗MRSA和抗生物膜活性。
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  GHa11R减轻LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。
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  GHa11R通过抑制NF-κB和MAPK通路抑制M1极化。
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  GHa11R促进角质形成细胞和内皮细胞功能。
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  GHa11R加速小鼠MRSA感染伤口愈合。

引言

细菌感染构成全球性的严重健康威胁，每年导致约770万人死亡，占全球死亡人数的八分之一。其中，495万例死亡与抗菌药物耐药（AMR）相关[1]。最令人担忧的病原体之一是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），这是一种多重耐药菌株，已成为全球医院获得性感染和社区获得性感染的主要致病菌之一[2]。MRSA感染呈慢性且难治性特征的关键因素在于其形成生物膜的能力。生物膜可保护细菌免受抗生素作用，从而引发持续性感染，如慢性伤口感染和感染性心内膜炎[3]。伤口感染是外科患者死亡的主要原因，在烧伤患者中导致70-80%的死亡[4]。不同地理区域和临床环境中从感染伤口中分离的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株中MRSA的流行率差异显著，某些地区的检出率超过50%[5]，[6]。一旦这些病原体定植于创面，便容易形成生物膜，增加局部细菌负荷，破坏免疫调节，并维持过度的炎症反应，从而显著阻碍伤口愈合过程[7]。

伤口愈合是一个精密调控的生物学过程，通常包括四个相互重叠的阶段：止血、炎症、增殖和组织重塑。这一复杂的修复反应需要巨噬细胞、角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞等多种细胞以及一系列细胞因子和生长因子之间精确的时空协调[8]，[9]。作为固有免疫系统的重要组成部分，巨噬细胞在整个伤口愈合过程中发挥着关键作用[10]，[11]。巨噬细胞可大致分为经典激活（M1）和替代激活（M2）表型[12]。在炎症期，M1巨噬细胞分泌大量促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β），以激活免疫反应、吞噬病原体和清除坏死碎片[13]。进入增殖期后，M2巨噬细胞逐渐占据主导地位，分泌抗炎因子，包括白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β），以调节炎症反应、促进血管新生并促进组织修复[14]，[15]。巨噬细胞极化从M1到M2的及时转变对于伤口修复过程成功过渡到增殖/促愈合阶段至关重要[16]。然而，在感染性伤口中，MRSA等病原体形成的生物膜持续释放毒力因子，引发过度的炎症反应，维持M1激活状态并抑制向M2表型的转化，从而延长炎症期并损害组织再生[17]。因此，能够同时清除感染病原体和重新平衡巨噬细胞极化的治疗药物在解决感染性伤口方面具有巨大的应用前景。

尽管抗生素传统上是治疗微生物感染（包括伤口感染）的主要方法，但不断加剧的AMR问题已显著降低了其疗效[18]。因此，迫切需要开发新型多功能抗感染药物。

抗菌肽（AMPs）因其广谱抗菌活性和较低的耐药性诱导倾向而成为极具前景的候选药物。除了直接的病原体杀灭能力外，AMPs还具有免疫调节功能，能够减轻感染微环境中的过度炎症并加速伤口修复[19]。例如，据报道，肽Andersonin-W1可通过TLR4/NF-κB轴调节巨噬细胞极化，减少脂多糖（LPS）诱导的过度炎症，并加速皮肤伤口愈合[20]。

两栖动物皮肤分泌物是AMPs的丰富来源，迄今为止从蛙类中已鉴定出超过1000种肽[21]，[22]。其中，temporin家族由10-14个氨基酸残基组成，被认为是结构最简单的天然AMP之一，使其成为分子设计和优化的理想模板[23]。在我们先前的研究中，我们克隆了来自黑斑侧褶蛙（Hylarana guentheri）的天然肽temporin-GHa（GHa），但其抗菌活性较弱。为了获得具有强效抗MRSA和抗生物膜活性的AMPs，我们分析了抗MRSA和抗生物膜肽的氨基酸组成。比较发现，这些肽中精氨酸（R）的出现频率高于temporin家族肽，提示R对抗MRSA和抗生物膜活性有关键贡献，为序列设计提供了指导。鉴于溶血肽中R的出现频率较低，我们选择用R替换GHa第11位组氨酸（H），从而得到单点突变肽temporin-GHa11R（GHa11R）。在本研究中，我们通过体外和体内分析，研究了GHa11R对MRSA的抗菌和抗生物膜活性及其抗耐药性潜力，并进一步探讨了其在调节巨噬细胞极化和促进MRSA感染伤口愈合中的作用及其潜在机制。本研究旨在为慢性感染伤口治疗药物候选物的开发提供替代策略和实验证据。

章节摘要

肽设计、理化表征与合成

采用基于模板和数据库辅助的设计策略相结合的方法开发新型抗菌肽[24]。具体而言，利用生物信息学方法收集并整合多个抗菌肽数据库中的统计数据，并使用APD6数据库（https://aps.unmc.edu/）分析抗MRSA肽和溶血肽的氨基酸组成谱。根据这些统计结果，利用……设计了肽GHa11R

GHa11R的设计、理化性质与结构特征

基于对抗菌肽和溶血肽数据库的生物信息学分析[21]，[24]，发现精氨酸（R）在抗MRSA肽中出现频率较高（7.74%），但在溶血肽中出现频率较低（图S1A和B）。据此，我们通过将GHa第11位的H替换为R，生成了GHa11R。

强效α螺旋AMPs通常具有较高的亲水亲脂性、较高的疏水矩、正的GRAVY值以及接近或低于0的Boman指数（BI）[26]。与GHa相比，

讨论

耐药病原体的出现，特别是MRSA，迫切需要通过不同于传统抗生素机制的新型抗菌药物来应对。尽管万古霉素仍被视为最后防线，但万古霉素耐药菌株的出现凸显了当前治疗的局限性以及需要替代治疗策略。

在本研究中，我们采用了天然存在的抗菌肽GHa，

结论

本研究证明，GHa11R是一种多功能肽，集成了强效抗MRSA活性、抗生物膜能力以及免疫调节和促修复功能。它对MRSA表现出杀菌活性，诱导耐药性倾向低，能够有效抑制生物膜形成，同时清除已形成的成熟生物膜。值得注意的是，GHa11R能够诱导细菌胞质膜去极化并穿透膜积累

CRediT作者贡献声明

Lan Yawen：撰写——初稿、方法学、调查研究、数据管理。Wang Yuhuan：方法学。Xie Zhipeng：调查研究。Jin Xiao：数据管理。Tan Xiuchuan：数据管理。Ren Jie：调查研究。Zha Yanmei：方法学。Tang Jingxuan：方法学。Chen Yuran：方法学。Wang Rong：监督、资金获取。Zhang Yingxia：监督、项目管理、资金获取。

作者声明

我们声明，本手稿是原创的，未曾发表，目前也未提交至其他出版机构考虑发表。

我们确认，手稿已获所有署名作者阅读并批准，且不存在符合作者资格但未列出的人员。我们进一步确认，手稿中列出的作者顺序已获所有人批准。作者声明不存在利益冲突。

我们理解通信作者

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或可能影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金委员会（项目编号 32560221 资助 Y. Zhang，项目编号 82460695 资助 R. Wang），以及海南省重点研发项目（项目编号 ZDYF2025SHFZ033）。

Yawen Lan|Yuhuan Wang|Zhipeng Xie|Xiao Jin|Xiuchuan Tan|Jie Ren|Yanmei Zha|Jingxuan Tang|Yuran Chen|Rong Wang|Yingxia Zhang