《International Immunopharmacology》：Quadruple HLA-I/II gene homo/heterozygous knockout hESC line: generation, multi-omics profiling, pluripotency, and immunogenicity
编辑推荐：
•本研究介绍了两种新型人类胚胎干细胞（hESC）系，分别具有HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?和HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?/-B?/?基因敲除特征。•该报告首次揭示了具有HLA基因敲除特征的人类胚胎干细胞的多组学特征。•数据分析表明，这些H
- •
本研究介绍了两种新型人类胚胎干细胞（hESC）系，分别具有HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?和HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?/-B?/?基因敲除特征。
- •
该报告首次揭示了具有HLA基因敲除特征的人类胚胎干细胞的多组学特征。
- •
数据分析表明，这些HLA三重/四重基因敲除的人类胚胎干细胞仍保持多能性，并且具有较低的免疫原性。
- •
这些发现为开发低免疫原性的人类胚胎干细胞展示了重要的应用前景和参考价值。
引言
人类胚胎干细胞（hESC）具有自我更新能力、多向分化潜能[1]，在适当条件下可分化为造血细胞[2]、神经细胞[3]和心肌细胞[4]，使其成为再生医学、药物检测和疾病模型研究的理想细胞来源[5]。随着干细胞研究的快速发展，自1998年人类胚胎干细胞首次被建立为细胞系以来，基于hESC的细胞在血液系统、神经系统、心血管系统和内分泌系统疾病的治疗方面取得了重大突破，充分展示了其巨大的应用潜力[6]、[7]。
hESC的分化衍生物有望缓解临床移植中对供体组织和器官的依赖。然而，与其他异体移植一样，基于hESC的移植也面临着免疫排斥的挑战[8]。目前，组织分型和免疫抑制疗法是防止移植受体术后排斥反应的主要手段[9]。在移植组织分型中，HLA分型是核心指标[10]。然而，HLA位点的极高多态性导致HLA分型的匹配率极低，严重限制了移植治疗的临床应用[11]、[12]。另一方面，免疫抑制疗法也会给受体带来骨髓抑制、器官毒性、感染和癌症等严重风险[13]、[14]。构建能够逃避受体免疫监视的hESC（即低免疫原性hESC）有望消除临床移植中对HLA分型和免疫抑制疗法的需求[15]。通过敲除某些HLA基因来生成具有HLA缺陷的hESC可能是实现免疫逃逸的重要途径。
目前，已有研究尝试通过B2M和CIITA基因敲除来全面消除多能干细胞中的HLA分子[16]，或对单个或多个HLA位点进行双重等位基因敲除[17]。同时，也有报道提到跨多个HLA位点的等位基因特异性敲除，以及通过杂合子筛选保留特定等位基因的方法[18]、[19]。尽管B2M基因敲除相对容易实施，但其结果导致广泛的HLA I类蛋白组装异常，从而存在显著局限性[20]、[21]。例如，B2M基因敲除后HLA I类蛋白的广泛丢失会激活NK细胞攻击基因工程细胞[20]、[21]。这些HLA编辑策略可以在不同程度上降低hESC的免疫原性，但目前尚无公认的有效策略能将hESC的免疫原性降至临床可接受的水平。因此，需要探索更有效的基因编辑方法以促进hESC的广泛应用。
HLA基因家族包含许多成员，功能复杂且具有复杂的调控机制。其中，HLA-A、HLA-B、HLA-DR和HLA-DQ分子与细胞免疫原性和移植排斥反应最为相关[17]、[22]。我们的研究小组先前构建了一种具有HLA-DRA和HLA-DQA1双基因敲除特征的单克隆人类胚胎干细胞系（简称DKO）。本研究利用CRISPR/Cas9技术依次敲除了DKO细胞系中的HLA-A和HLA-B基因，获得了单克隆的HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?三基因敲除系（简称TKO）和HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?/-B?/?四基因敲除系（简称TKO和QKO），并通过多组学分析、体外细胞培养实验和体内小鼠实验评估了这些hESC系的多能性和免疫原性，旨在为开发低免疫原性hESC及其临床应用奠定基础。
章节摘录
实验动物和细胞
实验动物：由GemPharmatech有限公司提供的特定无病原体（SPF）四周龄雌性NCG小鼠，是通过敲除NOD/ShiltJGpt小鼠的Prkdc和Il2rg基因而产生的严重免疫缺陷小鼠，这些小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞完全缺失。8周龄的SPF免疫健全BALB/c雌性小鼠购自Charles River Laboratories。本研究已获得郑州大学生命科学伦理审查委员会的批准。
人类胚胎干细胞
HLA-A靶向质粒构建的验证
Sanger测序结果显示，针对HLA-A的质粒已按设计建造完成。图S1和S2展示了针对HLA-A的质粒1和质粒2中的gRNA区域的Sanger测序结果。
HLA-A敲除的验证
HLA-A敲除是通过脂质体介导的质粒传递系统在DKO细胞中实现的。最终选择了质粒1（gRNA1-gRNA2），因为其转染效率高于质粒2（gRNA3-gRNA4）。
讨论
目前，免疫排斥仍然是hESC临床应用的重要障碍。如果能够生成能够逃避受体免疫监视的hESC，可能会消除临床移植中对HLA分型和免疫抑制疗法的需求[15]。HLA-A、-B和-C基因各拥有数千种等位基因，且表现出高度的多态性[23]。截至目前，关于究竟应敲除哪个HLA I类基因、每种基因应敲除到何种程度，仍没有共识。
结论
本报告首次报道了单克隆的HLA-DRA?/?/-DQA1?/?/‐A+/?/-B?/?高精度敲除hESC系，这些细胞表现出完整的多能性并具有较低的免疫原性趋势，尽管数据尚未显示免疫原性存在统计学上的显著差异。本文中使用的hESC HLA-A/-B杂合/纯合敲除的有效策略及其特性分析，以及hESC系的多组学特征，都具有重要的应用潜力和参考价值。
CRediT作者贡献声明
张凌涵：撰写——原始草案、可视化、验证、软件开发、方法研究、数据分析、概念构建。蔡波：方法研究。李小晓：研究工作。刘彦星：研究工作。陆萍：研究工作。刘玉琴：研究工作。雷文卓：研究工作。毛 Genhong：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金争取。
伦理批准
本研究已获得郑州大学生命科学伦理审查委员会的批准，并通过了郑州大学医学院实验动物平台的伦理审查（ZZU-LAC20220322）。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（编号81971454）和河南省自然科学基金（编号262300421534）的资助。
作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
张凌涵|蔡波|李小晓|刘彦星|陆萍|刘玉琴|雷文卓|毛 Genhong
