缺氧介导的胶质母细胞瘤细胞与巨噬细胞经TIMP1-LRP1轴串扰驱动免疫抑制

《International Immunopharmacology》：Hypoxia-mediated glioblastoma cell-macrophage crosstalk via the TIMP1-LRP1 axis induces immunosuppression

　　

缺氧介导的胶质母细胞瘤（GBM）细胞-巨噬细胞经组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP1）-低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）轴的串扰诱导免疫抑制。缺氧肿瘤相关巨噬细胞（hTAMs）呈现免疫抑制状态，并与GBM患者较差生存相关。hTAMs与缺氧GBM细胞（hGBM cells）共定位于坏死周围缺氧龛。缺氧GBM细胞通过TIMP1-LRP1-蛋白激酶B（AKT）信号向巨噬细胞传递信号。肿瘤内在Timp1耗竭在体内减少免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。

胶质母细胞瘤（GBM，IDH野生型（IDH-WT）IV级胶质瘤）恶性程度高且预后差，其肿瘤微环境（TME）中的缺氧可促进肿瘤生长并恶化患者预后。肿瘤相关巨噬细胞/小胶质细胞（TAMs）在GBM中可占细胞组成50%以上，尤其在TCGA间充质亚型（TCGA-MES）中更为突出。位于或邻近缺氧区的TAMs被称为缺氧TAMs（hTAMs），其浸润可改变肿瘤免疫微环境、细胞比例和细胞互作，进而影响肿瘤细胞增殖、迁移及患者预后。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组测序（stRNA-seq）为识别hTAMs及解析空间模式下的细胞互作提供了条件。缺氧肿瘤区常呈免疫抑制微环境，缺氧可直接影响巨噬细胞极化，但免疫抑制也可能源于缺氧龛内巨噬细胞与其他细胞的互作。TIMP1最初被鉴定为胶原酶内源性抑制剂，通过调控基质金属蛋白酶（MMP）活性参与细胞外基质（ECM）重塑；新证据提示TIMP1还可调节TAMs极化状态。LRP1为多功能细胞表面受体，介导配体内吞和信号转导，参与胆固醇代谢、炎症及肿瘤进展。尽管TIMP1与LRP1均独立参与肿瘤发病，但二者在GBM肿瘤生态系统中的潜在互作尚未被阐明。因此，研究人员开展单细胞组学、空间分布、细胞互作及功能验证研究，旨在解析hGBM细胞与hTAMs之间的互作机制及其临床意义，为GBM免疫治疗和临床应用提供新视角。

关键技术方法（不超过250字）：整合已发表11例及未发表2例GBM scRNA-seq数据（共132,209个细胞）和已发表空间转录组数据，采用基因集变异分析（GSVA）、CellPhoneDB、NicheNet、BayesPrism等分析；使用176例TCGA-GBM、15例原发IDH1/2野生型GBM标本及患者外周血来源人单核细胞衍生巨噬细胞（hMDMs）；构建GL261、CT2A原位小鼠模型及Timp1敲低模型，结合免疫荧光（IF）、流式细胞术、定量PCR（qPCR）、免疫印迹和免疫共沉淀（Co-IP）验证。

研究结果：
3.1 hTAMs exhibit heightened immunosuppressive properties（hTAMs呈现增强的免疫抑制特性）：研究人员整合11例已发表和2例未发表GBM scRNA-seq数据，经UMAP降维将细胞分为肿瘤细胞、少突胶质细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、肥大细胞、TAMs及未定义细胞等；不同GBM病例细胞组成差异明显，TAMs和肿瘤细胞占优。基于“细胞对缺氧反应”基因集计算缺氧评分，发现缺氧高组患者总生存显著更差；hTAMs较非缺氧TAMs（nhTAMs）中促炎M1样巨噬细胞比例显著降低、抗炎M2样巨噬细胞比例显著升高、未活化M0比例显著降低；hTAMs中除缺氧反应通路外，免疫激活和免疫抑制相关通路显著上调。由此得出缺氧促进巨噬细胞活化并诱导免疫抑制性极化。

3.2 hTAMs are associated with poorer prognosis（hTAMs与较差预后相关）：研究人员以hTAMs与nhTAMs差异表达基因构建hTAMs特征评分，在TCGA样本中经GSVA计算并分层，发现hTAMs特征评分较高患者生存显著更差；KEGG缺氧通路与hTAMs基因集重叠基因很少，提示hTAMs特征的预后影响并非仅由缺氧通路基因冗余驱动。

3.3 hTAMs enrichment characterizes TCGA-MES GBM（hTAMs富集刻画TCGA-MES型GBM）：研究人员对176例TCGA转录组数据行去卷积分析，发现不同分子亚型中hTAMs和nhTAMs比例差异显著，临床预后最差的TCGA-MES亚型hTAMs比例最高；对15例GBM标本（PN/CL/MES各5例）行特征评分，发现MES亚型标本中肿瘤细胞和巨噬细胞的缺氧评分显著升高。

3.4 hGBM cells share the spatial patterns with hTAMs（hGBM细胞与hTAMs共享空间模式）：研究人员利用空间转录组数据按缺氧反应基因集计算每个空间位点缺氧评分，并以单细胞来源差异表达基因计算hTAMs和hGBM细胞特征评分；空间热图显示缺氧高区域中hTAMs与hGBM细胞特征评分一致富集，表明二者在缺氧龛内空间共定位。GL261-copGFP小鼠模型显示IBA1⁺巨噬细胞与copGFP⁺肿瘤细胞在GLUT1⁺缺氧区空间重叠；坏死腔周围缺氧富集区仍保留存活肿瘤细胞及核形态，并可见IBA1⁺巨噬细胞与copGFP⁺肿瘤细胞明确共定位，提示该空间关联发生于存活缺氧龛而非无细胞坏死区。

3.5 hGBM cells interact with hTAMs though TIMP1-LRP1 axis（hGBM细胞通过TIMP1-LRP1轴与hTAMs互作）：CellPhoneDB分析显示hGBM细胞-hTAMs互作强度显著高于nhGBM细胞-nhTAMs配对。以TAMs为“接收者”、肿瘤细胞为“发送者”的NicheNet配体-靶标建模显示，hTAMs对hGBM细胞来源配体反应增强，包括VEGFA、SPP1、LGALS3及TIMP1；配体-受体预测中LRP1与TIMP1配对可能性最高。独立在研人GBM scRNA-seq队列重复聚类、缺氧评分和配体-受体推断，TIMP1在hGBM细胞中显著富集并与缺氧评分正相关；空间转录组显示TIMP1在hGBM富集肿瘤区域表达升高，TCGA中TIMP1在MES样GBM分子亚型升高。

3.6 Hypoxia induces TIMP1 overexpression in tumor cells to promote macrophage immunosuppressive shift（缺氧诱导肿瘤细胞TIMP1过表达以促进巨噬细胞免疫抑制性转变）：小鼠GL261和人U-87MG胶质瘤细胞在1% O₂缺氧12 h后，qPCR证实Timp1/TIMP1上调。THP-1和Raw264.7巨噬细胞经LPS+IFN-γ极化为M1后给予重组TIMP1（rTIMP1），两模型均显示M1标志物下调、M2标志物上调，免疫印迹证实Raw264.7中iNOS降低；提示TIMP1将巨噬细胞重编程为免疫抑制性M2样表型。患者外周血CD14⁺单核细胞分化为hMDMs后，rTIMP1使M1相关基因CD68、CXCL11、NOS2表达升高并调节M2相关标志ARG1、CD163、IL10，蛋白水平iNOS和CD68升高、CD163和ARG1降低，原文称支持人巨噬细胞中保守的极化效应。GL261细胞Timp1敲低后，其条件培养基对hMDMs的极化诱导作用在转录和蛋白水平显著减弱；缺氧增强肿瘤条件培养基诱导的巨噬细胞重编程，而Timp1敲低削弱该反应，提示肿瘤来源TIMP1在该效应中贡献显著。

3.7 TIMP1-LRP1 axis reprograms hTAMs into immunosuppressive state（TIMP1-LRP1轴将hTAMs重编程为免疫抑制状态）：人GBM scRNA-seq显示LRP1特异富集于TAMs，且在hTAMs中表达峰值最高；空间转录组显示LRP1转录本与hTAMs特征在缺氧龛内共定位；TCGA生存分析显示LRP1高表达与患者预后显著更差相关。Raw264.7细胞Lrp1敲低后，rTIMP1在对照巨噬细胞中显著增加AKT Ser473磷酸化，而Lrp1缺失完全消除该激活；rTIMP1引起的M1/M2标志物蛋白和转录变化在Lrp1敲低细胞中大多被逆转。Co-IP显示rTIMP1-His可在对照细胞中有效拉下LRP1，Lrp1敲低组LRP1结合明显减少，IgG对照无信号，提示TIMP1与巨噬细胞膜LRP1直接关联。上述结果说明TIMP1结合LRP1激活AKT Ser473磷酸化，驱动免疫抑制性巨噬细胞极化，并与hTAMs表型趋同。

3.8 Tumor-intrinsic TIMP1 depletion improves anti-tumor immunity（肿瘤内在TIMP1耗竭改善抗肿瘤免疫）：研究人员用两种独立shRNA构建GL261、CT2A和U87稳定Timp1敲低细胞；CCK-8显示GL261和CT2A增殖能力未显著改变，U87在TIMP1耗竭后增殖降低。原位C57BL/6模型中，GL261和CT2A的Timp1敲低肿瘤小鼠生存显著延长；IF显示GL261和CT2A中CD206⁺巨噬细胞密度显著降低；H&E显示GL261 Timp1敲低肿瘤坏死区域和微出血特征增加；流式显示CD45⁺CD11b⁺ TAMs比例显著降低；分选TAMs的qPCR显示促炎标志物升高、免疫抑制标志物降低。由于GL261和CT2A中Timp1敲低未显著影响增殖，体内生存改善不太可能源于内在肿瘤生长缺陷，支持TIMP1驱动胶质瘤进展主要通过免疫调节机制。

讨论部分总结：研究人员解析了hTAMs转录组身份及hGBM细胞与hTAMs间细胞通讯。GBM缺氧源于快速增殖且代谢活跃肿瘤细胞高氧需求与异常功能障碍的瘤内血管网络供氧不足之间的失衡。体外和体内模型表明，缺氧肿瘤细胞通过上调TIMP1分泌促进巨噬细胞向免疫抑制表型极化。TIMP1原为天然胶原酶抑制剂，主要调控MMP活性和ECM重塑，其表达与肿瘤不良预后相关；TIMP1含N端结构域（N-TIMP1）和C端结构域（C-TIMP1），N-TIMP1包含MMP抑制位点，C-TIMP1生物学功能尚不清楚。TIMP1介导的肿瘤-巨噬细胞免疫调节究竟依赖经典金属蛋白酶抑制活性，还是通过C端结构域介导的未被认识功能，仍是重要未解问题，对理解缺氧驱动免疫抑制机制及靶向治疗策略具有重要意义。hTAMs与hGBM细胞基因集差异显著，但空间转录组显示二者共享空间模式，提示GBM细胞和TAMs以不同信号通路适应缺氧微环境；hGBM细胞与hTAMs间驻留互作可能促进细胞存活和缺氧龛适应。NicheNet预测hGBM细胞通过TIMP1-LRP1配体-受体轴影响hTAMs，影响TAMs增殖、迁移及缺氧环境适应；TIMP1-LRP1轴也可能直接影响hGBM细胞，抑制肿瘤免疫反应并促进肿瘤生长，其功能和机制尚需进一步研究。Sattiraju.et.al报道GBM缺氧由适应性免疫驱动导致血管异常，而非仅由快速肿瘤扩增超过血供所致；但该假说不能完全解释TCGA亚型间hTAMs比例差异。免疫缺陷小鼠患者来源异种移植（PDX）模型中亦发现血管异常和缺氧，并受GBM转录组身份影响，增加缺氧因果理解复杂性。结合血管异常和TAMs比例，研究人员关注肿瘤细胞转录组异质性可能是缺氧多样性的来源；据其发现，TCGA-MES更可能诱导血管异常和缺氧，TAMs亦被认为是导致血管异常的驱动因素。原文提出假说：MES样GBM诱导TAMs浸润并改变TAMs状态，进一步促进血管异常和TAMs浸润；一旦该正反馈环路形成，缺氧得以维持；缺氧虽可诱导血管内皮生长因子（VEGF）表达促进血管生成以缓解缺氧，但异常血管出现可能反而加剧缺氧。研究局限性包括：缺氧相关通讯可能为多因素，除TIMP1-LRP1轴外还可能有其他配体-受体通路塑造TAM状态；机制分析主要基于实验小鼠模型和选定人样本，仍需更大独立人GBM队列验证；用于转录组和组织学验证的患者样本量有限；体内研究仅纳入雄性小鼠，未评估性别特异性效应；Timp1耗竭对其他免疫细胞群体及治疗反应的影响未直接评估。

研究结论部分翻译：综上所述，研究人员解析了hTAMs的转录组身份及hGBM细胞与hTAMs间的细胞通讯；在缺氧GBM微环境中，hGBM细胞通过上调TIMP1分泌并经LRP1-AKT信号促进巨噬细胞免疫抑制表型。理解hTAMs转录组身份及hTAMs与hGBM细胞相互影响，将深化对缺氧情境的认识并可能促进临床转化；该研究为GBM治疗提供新思路和潜在治疗靶点。