《PLOS MEDICINE》：Plasma proteomic signatures of subclinical atherosclerosis progression for cardiovascular risk stratification: A cohort study
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背景：现有的风险分层工具无法充分识别可从早期干预中获益的亚临床动脉粥样硬化（subclinical atherosclerosis, SA）个体。本研究旨在开发用于SA进展的蛋白质风险评分（protein risk scores, ProtRSs
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背景：现有的风险分层工具无法充分识别可从早期干预中获益的亚临床动脉粥样硬化（subclinical atherosclerosis, SA）个体。本研究旨在开发用于SA进展的蛋白质风险评分（protein risk scores, ProtRSs），并评估其对动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD）风险预测的增量价值。
方法与发现：在一个包含903例接受重复SA评估（冠状动脉钙化[cac]或颈动脉斑块）的社区队列中（2008–2009年至2013–2014年，为期6年），研究人员采用最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归从117种蛋白质panel中筛选生物标志物，分别构建CAC和斑块进展的SA ProtRSs，并基于指南推荐的传统风险评分，在包含1,835例个体的病例-队列（case-cohort）中（2007–2008年至2018–2021年，中位随访10.4年）评估其对ASCVD发病风险的预测能力。CAC和斑块进展的ProtRSs各包含14种蛋白质，分别解释了17.1%和18.4%的相应方差。这些蛋白质对SA进展的效应量与对ASCVD发病的效应量高度一致（r > 0.75）。CAC和斑块ProtRSs每增加一个标准差，ASCVD风险的HR分别为1.36（95% CI [1.20, 1.54]）和1.38（95% CI [1.23, 1.54]）。将SA ProtRSs加入传统风险评分后，净重分类改善指数（net reclassification improvement, NRI）为0.127（p < 0.001）。重要的是，18.6%的传统中危个体被重新分类为高危（10年ASCVD事件率：10.9%），提示需要预防性干预；而32.8%的传统高危个体被识别为具有更高的风险（13.7%），提示需要强化管理。主要局限性在于ProtRSs的预测价值有待进一步大规模外部验证。
结论：冠状动脉钙化和颈动脉斑块进展的SA ProtRSs可能在传统风险评估之外提供额外价值，凸显了其在精细化风险分层和指导靶向干预策略方面的潜力。
论文解读文章
一、研究背景与问题提出
动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD）仍是全球疾病负担和死亡的主要贡献因素。尽管现行临床指南推荐基于已确立的心血管危险因素进行一级预防风险评估，但越来越多的证据揭示了传统风险分层的显著局限性：部分被传统风险评分判定为中危甚至低危的个体，仍可能携带相当程度的动脉粥样硬化负担并易发生疾病进展。这一缺口凸显了检测亚临床动脉粥样硬化（subclinical atherosclerosis, SA）的重要性——SA是ASCVD的早期关键阶段，在此阶段采取预防措施可能产生更强的影响。目前指南推荐基于影像的冠状动脉钙化（coronary artery calcium, CAC）评分作为ASCVD风险评估的增强因素，但广泛开展CAC扫描的可行性受限于CT设备可及性、辐射暴露和成本效益问题。因此，亟需开发敏感且广泛可及的评估动脉粥样硬化负担的方法。
近年来蛋白质组学技术的进展使得大规模人群研究能够定量检测血浆蛋白水平。多项欧洲队列研究已发现与动脉粥样硬化病变相关的蛋白质生物标志物，如生长分化因子15（GDF-15）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白域1（TIM-1）。然而，这些研究大多基于横断面设计，难以确定蛋白质改变是先于动脉粥样硬化发展还是仅反映其同步病理。这一局限性凸显了在前瞻性队列中识别驱动SA进展的蛋白质生物标志物的必要性，此类标志物对未来的ASCVD事件具有预测价值。此外，这些蛋白质生物标志物在传统评分之外改善风险分层的程度，尤其是在非欧洲人群中，仍缺乏充分研究。
为填补上述空白，本研究旨在：（1）在903例接受6年期间重复CAC或颈动脉超声测量的中国成人中，识别驱动SA发展的候选血浆蛋白；（2）将这些蛋白质整合为SA进展的蛋白质风险评分（protein risk scores, ProtRSs）；（3）在前瞻性病例-队列（1,835例参与者）中评估这些ProtRSs能否超越传统风险评分改善ASCVD预测。
二、研究设计与主要结论
研究人员基于北京社区动脉粥样硬化队列（2008–2009年入组1,087例，随访至2013–2014年，排除184例无蛋白质数据者后保留903例）作为发现队列，利用LASSO回归筛选与CAC或斑块进展相关的蛋白质，构建SA ProtRSs。验证队列采用巢式病例-队列设计，来源于InterASIA和ChinaMUCA两个队列，包含1,449例亚队列个体和501例额外发病病例，排除115例无蛋白质数据者后保留1,835例，中位随访10.4年。
研究发现，CAC和斑块进展的ProtRSs各包含14种蛋白质，分别解释了17.1%和18.4%的相应方差。CTSD、sdLDL、IL-2RA和PON3四种蛋白质同时被选入CAC和斑块进展评分。CAC ProtRS每增加一个标准差，CAC进展的相对风险（RR）为1.26；斑块ProtRS每增加一个标准差，斑块进展的RR为1.25。ProtRSs对CAC和斑块进展的AUC分别为0.711和0.725，加入传统危险因素后ΔAUC分别为2.2%和3.6%，均有显著改善。
在ASCVD预测方面，CAC和斑块ProtRSs每增加一个标准差，ASCVD风险的HR分别为1.36和1.38。高危ProtRS组相比低危组，ASCVD风险增加约3倍，冠心病风险增加4至5倍。将ProtRSs加入China-PAR风险评分后，C指数从0.724提升至0.742（ΔC-index 0.018），总NRI为0.127。在中危个体中，NRI达到0.416，其中34.9%的未来ASCVD事件被正确地从中间危升级为高危。18.6%的传统中危个体被重新分类为高危（10年ASCVD事件率10.9%），提示需要预防性干预；32.8%的传统高危个体被识别为具有更高风险（13.7%），提示需要强化管理。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：（1）蛋白质组学测量：使用Olink心血管-III panel（邻近延伸分析技术，92种蛋白质）、ELLA自动化ELISA微流控系统（14种炎症蛋白）和Beckman Coulter AU680临床生化分析（11种代谢蛋白）共定量117种血浆蛋白质，所有浓度经Z-score标准化；（2）LASSO回归结合10折交叉验证，进行1,000次迭代（每次随机选取90%样本），调整年龄和性别，选择在≥900次迭代中保持非零系数的蛋白质，再通过logistic回归构建ProtRSs；（3）前向逐步logistic回归验证蛋白质的生物学相关性，KEGG通路富集分析（ORA）探索富集通路；（4）采用Prentice Cox回归估计病例-队列中ProtRSs与ASCVD风险的HR；（5）通过Harrell's C指数（1,000次bootstrap）、分类NRI（切点5%和10%）评估增量预测价值；（6）使用Kaplan-Meier方法和1/抽样比例加权估计各风险类别的10年ASCVD事件率。
四、研究结果
（一）基线特征与SA进展率
发现队列（n=903）平均年龄54.3岁，54.9%为女性。基线时30.2%的参与者有可检测的CAC（CAC>0），39.1%的参与者至少有一个颈动脉斑块。中位随访6.1年间，33.4%的参与者发生CAC进展，22.0%发生斑块进展。进展者的基线年龄、吸烟比例、血压、甘油三酯、总胆固醇、糖尿病患病率和用药比例均高于非进展者。验证队列亚队列平均年龄55.9岁，55.0%为女性，中位随访10.4年间新增444例亚队列外ASCVD病例。
（二）构建驱动SA进展的蛋白质风险评分
通过LASSO回归，14种蛋白质被选入CAC进展风险评分（10个正向、4个负向），14种蛋白质被选入斑块进展评分（9个正向、5个负向）。CTSD在CAC进展中具有最大的正向效应量（中位效应量1.16），KLK6具有最大的负向效应（0.89）；斑块进展中胰岛素正向效应最大（1.15），CPB1负向效应最大（0.88）。前向逐步回归验证显示，LASSO选出的14种CAC相关蛋白中有11种、14种斑块相关蛋白中有13种被保留在最终模型中，两种方法估计的效应量高度相关（CAC：r=0.899；斑块：r=0.976）。KEGG通路分析显示，斑块进展相关蛋白（如CCL-24、IL-8）和CAC进展相关蛋白（如TNF-R2、uPA）与炎症过程相关，包括细胞因子信号传导和NF-κB激活；其他蛋白如低密度脂蛋白受体和MCP-1涉及脂质代谢和动脉粥样硬化通路。
SA进展率随ProtRS分组呈剂量-反应关系：CAC进展在低、中、高危CAC ProtRS组的发生率分别为14.6%、30.8%和60.6%。即使在传统低危和中危个体中，高危CAC ProtRS组仍分别表现出22.7%和58.3%的CAC进展率。调整传统危险因素后，CAC ProtRS中危和高危组相比低危组的RR分别为1.75和2.44；斑块ProtRS中危和高危组的RR分别为1.74和3.17（均ptrend<0.001）。ProtRSs每增加一个五分位，CAC进展风险增加42%，斑块进展风险增加57%。
（三）SA蛋白质风险评分与10年ASCVD风险
CAC ProtRS每增加一个标准差，ASCVD风险HR为1.36；斑块ProtRS每增加一个标准差，HR为1.38。相比低危组，CAC ProtRS中危和高危组的ASCVD HR分别为1.92和3.25；斑块ProtRS中危和高危组的HR分别为2.11和3.30。每个五分位增加对应ASCVD风险升高58%（CAC）和59%（斑块）。蛋白质对SA进展的效应量与对ASCVD发病的效应量呈强正相关（CAC：r=0.77；斑块：r=0.85）。对于冠心病，CAC和斑块ProtRSs每增加一个标准差，HR分别为1.58和1.59，高危组相比低危组的HR分别达4.52和5.44。对于缺血性卒中，斑块ProtRS每增加一个标准差，HR为1.20。
加入ProtRSs后，China-PAR模型的C指数从0.724提升至0.742（ΔC-index 0.018），总NRI为0.127（病例14.8%，非病例?2.1%）。在中危个体中，NRI达0.416，34.9%的未来ASCVD事件被正确地从中间危升级为高危，18.9%的病例被错误降级为低危。整合分析显示，18.6%的传统中危个体被ProtRS识别为高危，其10年ASCVD事件率为10.9%，超过指南推荐的药物干预启动阈值（10%）；同时被传统评分和ProtRS判定为高危的个体10年事件率达13.7%，提示需要强化风险管理。
五、讨论与结论
本研究从三个关键方面推进了对血浆蛋白质用于ASCVD一级预防的理解。第一，研究人员系统筛选了SA进展的蛋白质驱动因素，阐明了CAC和颈动脉斑块背后的生物学过程。与既往横断面研究不同，本研究的中位6年前瞻性随访能够识别先于并可能介导动脉粥样硬化进展的蛋白质。前向逐步回归验证了大多数LASSO选出的蛋白质可能具有生物学相关性。CTSD、sdLDL和PON3等共享蛋白涉及自噬相关炎症、脂质沉积、代谢调节和免疫调节等公认的动脉粥样硬化机制。KEGG通路分析进一步显示，斑块进展和CAC进展的蛋白质特征汇聚于驱动动脉粥样硬化形成的炎症和胆固醇稳态调节通路。此外，研究还发现了多个此前未充分认识的蛋白质生物标志物，如KLK6对CAC进展的保护性关联、转铁蛋白受体1（TR）在铁死亡和动脉粥样硬化中的角色、OPG和CPB1与斑块进展的关联，提示血管钙化和蛋白水解重塑在动脉粥样硬化发病中的作用。
第二，研究人员开发了CAC特异性和斑块特异性的ProtRSs，这些评分与SA进展和后续ASCVD事件均呈稳健关联。ProtRSs解释了SA进展近20%的表型方差，对应1.25倍的进展风险升高。值得注意的是，传统心血管生物标志物如NT-proBNP、LPA和PCSK9在本研究分析中与SA进展无显著关联，凸显了动脉粥样硬化定制风险评分的独特价值。蛋白质对SA进展的效应与对ASCVD发病的效应高度一致，支持蛋白质介导的早期动脉粥样硬化改变最终转化为临床心血管事件的因果链。
第三，ProtRSs在传统风险评估之外提供了ASCVD预测和重分类的增量价值。本研究的总体NRI为0.127，反映了参与者被适当重新分配到有临床意义的风险分层中。重分类获益在指南定义的中危个体中尤为显著（NRI 0.416）。中危个体被ProtRS重新分类为高危后，其10年ASCVD发病率达10.9%，超过指南推荐的药物干预启动阈值，提示ProtRS可作为风险增强因素指导临床决策。在传统高危人群中，ProtRS识别出的高危亚组10年事件率达13.7%，支持需要更积极的预防策略，尤其是在心血管干预依从性相对较差的中国人群中。
研究结论：反映冠状动脉钙化和颈动脉斑块进展的动脉粥样硬化特异性蛋白质风险评分，在传统风险评估工具之外提供了ASCVD预测的增量价值。这些评分有助于对SA进行靶向早期干预，在指南分类的中危个体中具有尤为突出的临床获益。研究的主要局限性在于：117种蛋白质panel可能未涵盖动脉粥样硬化蛋白质组的全谱；蛋白质-疾病关联的因果生物学机制需通过机制研究进行功能验证；ProtRSs的预测价值需进一步大规模外部验证和成本效益评估后方可在临床实践中应用。
