核受体亚家族1组D成员1（NR1D1）通过转录抑制干扰素基因刺激因子（STING）促进糖尿病小鼠伤口愈合

《The American Journal of Pathology》：Nuclear Receptor Subfamily 1 Group D Member 1 Promotes Wound Healing in Diabetic Mice through Transcriptional Repression of Stimulator of Interferon Genes

　　

糖尿病足溃疡是糖尿病最严重的并发症之一，主要由持续性炎症和血管新生受损驱动。本研究探讨了生物钟蛋白——核受体亚家族1组D成员1（NR1D1）在糖尿病伤口愈合中的作用，并阐明了其潜在机制。临床和实验分析显示，糖尿病患者和小鼠血清及皮肤伤口中的NR1D1水平显著降低，NR1D1下调与伤口闭合延迟相关。功能上，NR1D1敲除显著加剧了糖尿病小鼠的伤口愈合障碍，伴随促炎细胞因子升高和血管新生功能障碍。相反，NR1D1过表达抑制了IL-6和IL-1β的表达，并在体外挽救了高糖诱导的血管化缺陷。此外，NR1D1表达降低与糖尿病皮肤伤口及高糖处理的人脐静脉内皮细胞中干扰素基因刺激因子（STING）信号的过度激活相一致。荧光素酶实验证实，NR1D1直接抑制人STING启动子活性。综上所述，结果表明，NR1D1缺失通过激发炎症和失调内皮血管新生严重恶化伤口愈合，这一过程由高糖触发的NR1D1介导的STING转录沉默的去抑制所驱动。

研究背景与科学问题

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU）是糖尿病最致残的并发症之一，其5年死亡率高达30.5%，与癌症相当。DFU的核心病理特征在于持续性炎症反应、再上皮化障碍以及血管新生（angiogenesis）受损。核受体超家族成员NR1D1（又称REV-ERBα）是生物钟系统的核心组分，已知参与调控代谢、免疫和血管新生等多种生理过程。然而，NR1D1在糖尿病伤口愈合中的具体作用尚存争议：既有研究表明NR1D1/NR1D2联合敲除的骨髓移植可加速伤口愈合，也有证据显示生物钟分子Per1/Per2在糖尿病小鼠伤口中表达异常。与此同时，cGAS-STING信号通路的过度激活已被证实参与糖尿病相关组织损伤，但其上游转录调控机制尚不明确。基于上述矛盾与空白，研究人员开展本研究，旨在阐明NR1D1在糖尿病伤口愈合中的功能角色及其下游分子机制。

研究方法概述

研究人员首先收集西南医科大学附属医院20例2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者及20例健康对照者的外周血，以及3例DFU患者和3例健康对照者的皮肤组织，检测NR1D1表达。动物实验中，采用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）腹腔注射建立C57BL/6J小鼠及NR1D1全身敲除（NR1D1^-/-）小鼠的糖尿病模型，并在背部制作全层皮肤伤口模型。通过皮下注射AAV9-NR1D1实现NR1D1过表达。细胞实验选用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs），以30 mmol/L高糖刺激模拟糖尿病环境，并通过siRNA沉默和质粒转染分别实现NR1D1的敲低和过表达。关键技术包括：组织学分析（HE染色、Masson染色）、免疫组织化学/免疫荧光染色、Western blot、实时定量PCR、基质胶管形成实验，以及双荧光素酶报告基因实验（结合JASPAR数据库预测的NR1D1结合位点进行启动子截短突变分析）。

研究结果

NR1D1在糖尿病皮肤组织和高糖刺激的内皮细胞中表达显著降低：ELISA结果显示，T2DM患者血清NR1D1水平较健康对照显著下降；免疫组化染色进一步证实，DFU患者伤口组织中NR1D1表达减少，尤其在血管结构中降低最为明显。体外实验中，高糖处理后HUVECs的NR1D1呈现节律性改变，在同步化后24小时时间点显著低于正常糖对照组。

糖尿病小鼠伤口愈合受损伴随NR1D1下调：与正常小鼠相比，糖尿病小鼠在第3、7、11天的伤口面积分别增大71%、134%和103%。组织学分析显示糖尿病伤口中存在大量炎症细胞浸润、胶原纤维排列紊乱且数量减少，CD31免疫荧光染色提示微血管密度显著降低。同时，糖尿病小鼠血清及皮肤组织中NR1D1表达下降，而促炎因子IL-6和IL-1β升高、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）降低。体外管形成实验也证实高糖损害了HUVECs的成管能力。

NR1D1缺失加重糖尿病伤口愈合障碍，表现为持续炎症和血管重塑紊乱：在NR1D1^-/--DM小鼠中，伤口愈合进一步恶化，第3天和第7天伤口面积较单纯糖尿病小鼠分别增加40%和91%。组织学观察显示更显著的炎症细胞浸润和更少的胶原沉积，CD31阳性血管数进一步减少。血清和mRNA水平检测均表明，NR1D1敲除导致VEGF降低、IL-6和IL-1β升高。体外siRNA沉默NR1D1同样增强了HUVECs中IL-6和IL-1β的表达，并减少了管状结构数量和分支长度。

NR1D1过表达通过抑制促炎因子和增强血管新生加速糖尿病伤口愈合：AAV9介导的NR1D1过表达显著降低了糖尿病小鼠伤口中炎症细胞浸润，增加了胶原纤维沉积和CD31阳性血管密度。伤口面积在第3天和第7天分别缩小32%和38%。分子水平上，NR1D1过表达降低了IL-6和IL-1β，同时上调了VEGF。体外过表达NR1D1也恢复了高糖环境下HUVECs的成管能力。

高糖诱导的NR1D1下调解除其对STING的转录抑制，触发持续炎症和血管重塑障碍：糖尿病小鼠伤口组织和HUVECs中均观察到NR1D1表达下降与STING表达升高呈负相关。沉默NR1D1导致STING上调，而过表达NR1D1则抑制STING。双荧光素酶报告实验证实，NR1D1可直接结合于人STING启动子区域并抑制其转录活性；启动子截断突变分析将功能性结合位点定位至预测的位点3、4和5。进一步的共沉默实验表明，在NR1D1缺陷背景下敲低STING可显著降低IL-6和IL-1β水平，并部分恢复VEGF表达和管形成能力。

讨论与结论

本研究发现，糖尿病患者及STZ诱导的糖尿病小鼠血清和皮肤伤口中NR1D1水平显著降低。NR1D1缺失通过加剧炎症反应和损害血管新生恶化了糖尿病伤口愈合，而NR1D1过表达则可逆转这些病理改变。机制上，正常条件下NR1D1作为转录抑制因子直接结合于STING启动子，抑制其表达；高糖环境导致NR1D1下调，从而解除对STING的转录沉默，使STING过度活化，进而驱动持续的炎症反应和血管新生障碍。值得注意的是，该研究也存在局限性：人体组织样本量较小、解剖部位不匹配、缺乏严格的时序标准化采样，因此因果推论主要来源于动物和细胞模型。此外，由于缺乏高频时间分辨率数据，观察到的表型可能反映的是慢性高糖导致的整体生物钟抑制状态而非特定时相依赖的时钟调控。尽管如此，该研究首次揭示了NR1D1-STING轴在糖尿病伤口愈合中的关键作用，为DFU的治疗提供了新的潜在靶点。

研究结论翻译：总之，本研究表明，糖尿病患者和糖尿病小鼠的血清及皮肤伤口中NR1D1水平降低。此外，NR1D1表达下调通过持续性炎症和血管重塑紊乱恶化糖尿病伤口愈合。高糖诱导的NR1D1下调破坏了其对STING的转录抑制，从而触发了持续性炎症和血管重塑受损。