《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Cell-specific organization and paralog divergence of erythropoietin signaling in Atlantic salmon
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研究人员在大西洋鲑（Salmo salar）心脏和肾脏中，研究了4种epo旁系同源基因（paralogs）及epor（促红细胞生成素受体基因）的组织和细胞特异性表达。鉴定出旁系同源基因特异性表达模式。epo mRNA主要表达于心脏心肌细胞（cardiomyoc
研究人员在大西洋鲑（Salmo salar）心脏和肾脏中，研究了4种epo旁系同源基因（paralogs）及epor（促红细胞生成素受体基因）的组织和细胞特异性表达。鉴定出旁系同源基因特异性表达模式。epo mRNA主要表达于心脏心肌细胞（cardiomyocytes）和躯干肾（trunk kidney）小管上皮细胞（tubular epithelial cells）。epor mRNA在造血（hematopoietic）和非造血（non-hematopoietic）细胞类型中均有表达。
促红细胞生成素（EPO）是脊椎动物红细胞生成的主要激素调节因子，并通过促红细胞生成素受体（EPOR）参与非造血过程。哺乳动物成年期肾脏是EPO主要产生器官，但硬骨鱼中epo的组织分布与哺乳动物明显不同：肾脏以及心脏均可表达epo，epor主要见于肾脏和脾脏等红细胞生成器官，也见于多种非红细胞生成组织。大西洋鲑经历硬骨鱼祖先第三轮全基因组复制（Ts3R）和鲑科祖先第四轮全基因组复制（Ss4R），保留多个epo和epor旁系同源基因，为研究基因复制后的功能分化提供了条件。此前大西洋鲑中epo和epor的身份、组织分布及细胞定位仍不清楚，旁系同源基因特异性表达和细胞来源尚未界定，限制了对其造血与非造血功能的解释。基于此，研究人员表征了大西洋鲑心脏、头肾（head kidney）和躯干肾中epo与epor旁系同源基因的组织和细胞特异性表达，并结合发育阶段及急性失血后两个温度条件，分析心脏epo和肾脏epor的表达变化。研究结论表明，重复的epo旁系同源基因呈现不同表达谱，epo和epor mRNA定位于红细胞生成和非红细胞生成器官中的特定细胞生态位；这些结果支持WGD后epo旁系同源基因分化，并提示epor基因在硬骨鱼中的非造血作用，也使大西洋鲑成为研究WGD如何塑造激素信号系统组织与细胞特异性组织的模型。
关键方法概述（不超过250字）：研究使用3个实验组：组1和组2为Aquagen品系大西洋鲑，样本来自挪威Institute of Marine Research, Matre Research Station，分别用于组织/细胞表达表征和生活史阶段分析；组3为Stofnfiskur品系（Benchmark Genetics Iceland），样本来自挪威Veso Vikan Research Facility，置于海水5 °C或12 °C并实施急性失血。关键技术包括：基于NCBI完整编码序列的系统发育分析（人、斑点雀鳝、斑马鱼、白斑狗鱼和大西洋鲑；MAFFT比对、IQtree最大似然树、ModelFinder选模型、超快自举）；RNAscope原位杂交（ISH）检测epoa1、epoa2、epob1、epob2及epora1/epora2合并信号，ppib为阳性对照、dapB为阴性对照，并用QuPath定量图像；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测epoa2及epora1/a2，采用ΔΔCq法并以Sanger测序验证引物；血液分析测定血细胞比容（Hct）、血红蛋白（Hb）和未成熟红细胞。
研究结果如下。
3.1 鲑科特异性EPO和EPOR基因家族扩张
3.1.1 epo旁系同源基因保留自Ts3R和Ss4R WGD事件：通过系统发育分析，研究人员发现硬骨鱼epoa和epob两个支系分别对应Ts3R保留的旁系同源基因，大西洋鲑具有epoa1、epoa2、epob1和epob2四个epo旁系同源基因；染色体位置与Ss4R保留的共线性区块一致。序列比较显示epoa旁系同源基因间相似性高于epob旁系同源基因间相似性；epob2存在约70个氨基酸缺失，提示部分或完全功能丢失。THPO编码基因在所有物种中均为单拷贝。
3.1.2 EPOR编码旁系同源基因保留自Ss4R：通过系统发育分析，未发现Ts3R来源的EPOR旁系同源基因，但大西洋鲑一对epor基因与白斑狗鱼epor直系同源基因形成姐妹支，染色体位置与Ss4R保留一致，命名为epora1和epora2。epora1与epora2序列相似性很高，主要与其所在染色体臂在Ss4R后延迟二倍化有关；二者与人EPOR相似程度相近。
3.2 epo和epor表达的细胞定位
3.2.1 epo mRNA表达：通过ISH，心脏中epoa2信号最丰富，阳性细胞主要为心肌细胞，心房和心室心肌均可见，心室海绵层密度最高；epoa1在心肌细胞中散在阳性，epob1和epob2仅少量阳性，心房神经元中偶见epoa1、epob1和epob2信号。肾脏中epob1信号最丰富，主要定位于躯干肾小管上皮细胞，阳性信号在部分小管聚集，成熟和未成熟小管均可见；头肾和躯干肾造血组织、头肾内分泌细胞簇及神经细胞中偶见散在信号，其余epo探针多为散在阳性。
3.2.2 epor表达：通过ISH，epora1/a2转录本主要见于头肾和躯干肾造血组织、血管内血细胞以及心房和心室腔内的血细胞；也见于心肌细胞、心房神经元、头肾内分泌细胞簇、躯干肾小管上皮细胞和斯坦尼斯小体。
3.2.3 RT-qPCR组织mRNA表达：通过RT-qPCR，组织对epoa2表达有显著影响，心脏epoa2表达显著高于头肾和躯干肾，头肾与躯干肾之间无显著差异；epoa2在心脏扩增产物较短。组织对epora1/a2表达有显著影响，头肾和躯干肾表达显著高于心脏，头肾与躯干肾之间无显著差异；所有组织均观察到两个不同PCR产物。
3.3 心脏epo mRNA表达跨生活史阶段：通过比较降海Smolt、海水早期Post-smolt和海水后期Post-smolt心脏ISH，epo旁系同源基因空间分布总体保守，未见阶段特异性诱导或表达丢失；epoa2在各阶段均为优势旁系同源基因，阳性心肌细胞见于心房和心室，心室海绵层密度最高；epoa1也见于心肌细胞，海水组更常见，偶见心房神经元信号；epob1和epob2仅散在阳性。
3.4 急性失血的血液学反应：通过血液分析，急性失血显著影响Hct、Hb和未成熟红细胞；温度主效应不显著，但组别与温度对Hct存在显著交互。失血组在5 °C和12 °C均出现Hct和Hb显著降低，失血第1天与第2天之间无显著差异；未成熟红细胞在失血第2天视觉上较高，第1天与第2天间差异显著，而对照组与失血组间未达显著。
3.5 心脏epoa2表达的温度依赖性：通过心脏ISH结合定量图像分析，温度对心脏epoa2 mRNA有显著主效应，失血主效应及交互不显著；5 °C下失血第1天epoa2阳性信号显著高于同温度对照，第2天与对照无显著差异但两个个体信号较高；12 °C下对照与失血组无显著差异。肾脏中epora1/a2在头肾和躯干肾造血组织于各条件下均丰富，并见于头肾内分泌细胞簇和神经元、躯干肾斯坦尼斯小体及小管上皮细胞，未成熟肾单位样嗜碱性小管标记较强。
讨论部分总结：研究人员认为，鲑科较近期的WGD使大西洋鲑适合研究重复基因命运；epoa2在心脏占优势、epob1在肾脏占优势，其余旁系同源基因低信号可能反映渐进性功能丢失，也可能存在于本研究未检测组织、发育阶段或其他生理条件。epoa2转录本大小差异提示可变剪接。心脏epo表达主要位于心肌细胞，尤其心室海绵层，该区域由回流静脉血灌注，可能对血氧波动更敏感；与哺乳动物肾脏主导不同，硬骨鱼心脏显著表达反映epo组织水平组织方式的差异。肾脏epob1主要见于躯干肾小管上皮细胞，与哺乳动物以间质细胞为主不同，但与文献中其他肾细胞类型表达报道一致；低丰度散在信号需谨慎解释。epor在造血组织和外周血细胞丰富，未成熟红细胞可能贡献较大比例，但表达epora1/a2的血细胞类型尚不确定；非造血细胞中的epor表达与哺乳动物相符，未成熟小管中的表达支持EPO信号参与肾祖细胞增殖。心脏epo细胞身份在生活史阶段和实验条件下总体保守。温度依赖效应可能与HIF信号温度依赖性、低温延长贫血恢复、12 °C组可能更早响应或非心脏组织响应有关；样本量有限，尚不能对温度影响失血后红细胞生成反应作出结论性判断。
结论翻译：本研究提供了大西洋鲑epo基因的细胞分辨、旁系同源基因特异性分析，并对epor基因进行了细胞类型特异性研究。重复的epo旁系同源基因表现出不同表达谱，epo和epor mRNA定位于红细胞生成和非红细胞生成器官中的特定细胞生态位。这些发现支持WGD后epo旁系同源基因分化，并提示epor基因在硬骨鱼物种中的非造血作用。这些发现使大西洋鲑成为研究WGD如何塑造激素信号系统组织与细胞特异性组织的宝贵模型。
