眶下神经慢性压迫损伤后小鼠口面部神经病理性疼痛及非伤害性与伤害性样三叉神经Aβ传入神经元兴奋性增强的研究

《Molecular Pain》：Orofacial neuropathic pain and enhanced excitability of non-nociceptive-like and nociceptive-like trigeminal Aβ-afferent neurons in mice following infraorbital nerve chronic constrictive injury

　　

摘要专业翻译： 口面部神经病理性疼痛是一种令人衰弱的疼痛状态，因对其潜在神经生理机制认识不足，目前治疗效果欠佳。口面部神经病理性疼痛常由三叉神经分支（包括眶下神经（IoN））的损伤或功能障碍引起。临床上，口面部神经病理性疼痛的主要症状为机械性痛觉超敏（mechanical allodynia），即轻柔触碰即诱发剧烈疼痛。既往神经病理性疼痛研究主要关注C纤维和Aδ纤维传入的参与，而Aβ传入纤维对口面部神经病理性疼痛的潜在贡献尚未得到充分探索。在本研究中，研究人员建立了小鼠眶下神经慢性压迫损伤（IoN-CCI）模型，并评估了口面部疼痛行为及Aβ传入三叉神经节（TG）神经元（trigeminal ganglion neurons）的兴奋性。采用von Frey测试的行为学评估显示，术后3-4周IoN-CCI小鼠的机械敏感性较假手术组显著升高。基于机器学习的眼睑距离测量显示IoN-CCI小鼠出现眼眶收紧（orbital tightening），提示存在自发性疼痛。利用离体（ex vivo）TG标本及膜片钳记录，研究人员发现IoN-CCI小鼠中非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元的动作电位（AP）阈值均显著降低。与此一致的是，IoN-CCI后两类Aβ传入TG神经元的电压门控Na+电流均显著增加。研究结果表明，眶下神经损伤后非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元均发生过度兴奋，提示两类Aβ传入TG神经元可能均参与眶下神经损伤后口面部神经病理性疼痛的发生。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

口面部神经病理性疼痛是一种慢性且常令人衰弱的疼痛状态，可严重损害咀嚼、言语、睡眠和社交互动，并常伴有焦虑和抑郁等心理共病，对生活质量造成重大负担。口面部神经病理性疼痛的主要病因之一是三叉神经上颌支分支（包括眶下神经）的损伤或功能障碍，此类损伤可发生于面部创伤、牙科操作、颌面外科手术或其他涉及三叉神经的病理状态。尽管临床负担显著，目前可用的治疗手段往往缓解不足，凸显了深入理解其潜在细胞和分子机制的必要性。

口面部区域（包括下眼睑、鼻外侧、上唇和面颊）主要由眶下神经支配，该神经是三叉神经上颌支（V2）的主要分支，其初级传入神经元胞体位于三叉神经节（TG）的V2区域。传入神经元根据髓鞘化和传导速度（CV）可分为三大亚型：无髓鞘的C传入神经元、薄髓鞘的Aδ传入神经元和厚髓鞘的Aβ传入神经元。依据CV，小鼠初级传入纤维分类为：C传入（CV < 1.2 m/s）、Aδ传入（CV 1.2-10 m/s）和Aβ传入（CV > 10 m/s）。传统观点认为C和Aδ传入神经元分别是介导缓慢灼痛和快速锐痛的主要伤害性感受器，而Aβ传入神经元主要被视为参与无害触觉感知的低阈值机械感受器。然而，背根神经节（DRG）中已鉴定出一部分Aβ传入神经元为参与机械性疼痛的伤害性感受器，称为Aβ传入伤害性感受器。近期在三叉神经节神经元中也发现了Aβ传入伤害性感受器，其电生理标志为动作电位（AP）时程增宽及AP复极化相出现特征性拐折。

外周神经损伤后，三叉神经可发生过度兴奋，表现为机械性痛觉超敏的三叉神经病理性疼痛。既往神经病理性疼痛机制研究大多聚焦于C纤维和Aδ纤维伤害性感受器，而Aβ传入神经元在神经损伤后是否发生功能改变并参与神经病理性疼痛的证据正不断积累。在生理条件下，多数Aβ传入主要传导触觉和压力等无害机械刺激；外周神经损伤后，这些神经元可表现出兴奋性增加和信号处理通路改变，可能促进机械性痛觉超敏的发生。此外，外周神经损伤后Aβ传入伤害性感受器兴奋性可能增加，变得机械性超敏，从而促进机械性痛觉超敏。尽管Aβ传入已在多种病理性疼痛模型中被研究，但其在三叉神经病理性疼痛中的作用仍不完全清楚。特别是，眶下神经损伤后非伤害性和伤害性Aβ传入三叉神经节（TG）神经元的电生理特性和离子通道活性的潜在变化此前尚未被表征。为填补这一知识空白，本研究采用眶下神经慢性压迫损伤（IoN-CCI）小鼠模型，开展行为学评估和离体膜片钳电生理记录。

二、研究内容与主要结论

本研究建立了IoN-CCI小鼠模型，证明了口面部机械性痛觉超敏和自发性疼痛行为的存在，并进一步证明口面部神经病理性疼痛伴随非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元兴奋性增强。此外，研究显示IoN-CCI动物中两类Aβ传入TG神经元的电压门控Na⁺电流均显著增强。研究结果提示，Aβ传入三叉神经兴奋性增强可能参与三叉神经损伤后口面部神经病理性疼痛的发生。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：1）IoN-CCI小鼠模型建立，采用6-0铬肠线在眶下神经主干放置一根松散结扎线，轻度缩窄神经但不阻断神经外膜血流，手术单侧（右侧）进行，假手术组除不放置结扎线外其余步骤完全相同；2）行为学评估采用庇护管（sheltering tube）装置实现无束缚口面部行为测试，使用校准von Frey纤维丝（0.02 g、0.04 g、0.07 g）测定机械敏感性，并使用基于DeepLabCut 2.3.0深度学习的姿态估计方法进行眼睑距离分析以评估眼眶收紧（自发性疼痛指标）；3）离体TG标本制备结合膜片钳电生理记录，通过吸引电极电刺激眶下神经外周端测定传入CV（Aβ传入定义为CV > 10 m/s），在电流钳模式下表征AP参数，在电压钳模式下记录电压激活电流。实验动物为10周龄雄性C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA），行为学测试和电生理记录在术后4周进行。

四、研究结果

1. IoN-CCI小鼠口面部机械性痛觉超敏和自发性眼眶收紧

采用von Frey测试评估口面部机械敏感性。术后第2周，假手术组与IoN-CCI组反应频率无显著差异；第3周，假手术组反应频率为30.0 ± 4.5%（n = 6），IoN-CCI组显著升高至46.7 ± 5.6%（n = 6）；第4周，假手术组为38.3 ± 7.0%（n = 6），IoN-CCI组显著升高至60.0 ± 5.2%（n = 6）；第5周两组无显著差异。因此后续实验均在术后4周进行。在术后第4周，与假手术组相比，IoN-CCI小鼠对0.02、0.04和0.07 g三种von Frey纤维丝的反应频率均显著升高，其中对0.02 g低强度刺激的反应频率在假手术组为34.2 ± 4.7%（n = 12），IoN-CCI组显著升高至55.8 ± 4.3%（n = 12），表明存在口面部机械性痛觉超敏。采用DeepLabCut机器学习方法测量眼睑距离评估自发性疼痛，在5分钟无外部刺激的视频记录期间（9000帧图像），假手术组眼睑距离为2.8 ± 0.03 mm（n = 12），IoN-CCI组显著缩短至2.5 ± 0.05 mm（n = 12），表明IoN-CCI小鼠存在自发性眼眶收紧，提示存在持续性自发性疼痛。

2. 非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元的分类

在离体TG标本中对V2区域大直径TG神经元进行膜片钳记录，通过电刺激眶下神经测定传入CV，将CV > 10 m/s的神经元归类为Aβ传入TG神经元。根据AP波形特征进一步分类：AP时程< 1 ms且复极化相无拐折的为非伤害性样Aβ传入TG神经元，AP时程> 1 ms且复极化相有可见拐折的为伤害性样Aβ传入TG神经元。非伤害性样Aβ传入TG神经元AP时程为0.68 ± 0.04 ms（n = 15），伤害性样Aβ传入TG神经元AP时程为1.3 ± 0.08 ms（n = 6），两者差异显著。两类神经元的传入CV（非伤害性样：10.8 ± 0.20 m/s，n = 15；伤害性样：10.32 ± 0.15 m/s，n = 6）和胞体直径（非伤害性样：32.4 ± 0.5 μm；伤害性样：32.6 ± 0.13 μm，n = 6）均无显著差异。在胞体注入去极化电流诱发的AP中，非伤害性样AP时程为0.57 ± 0.03 ms（n = 15），伤害性样AP时程为1.34 ± 0.08 ms（n = 6），差异显著。AP阈值方面，非伤害性样为-36.9 ± 2.1 mV（n = 13），伤害性样为-27.6 ± 2.3 mV（n = 6），伤害性样显著高于非伤害性样。两类神经元在注入持续去极化电流时均只能诱发单个AP。

3. 非伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的活性膜特性变化

电刺激眶下神经诱发的AP显示，非伤害性样Aβ传入TG神经元的传入CV在假手术组为10.8 ± 0.2 m/s（n = 15），IoN-CCI组为11.0 ± 0.3 m/s（n = 15），无显著差异。两组均未观察到自发性AP。通过胞体注入去极化电流诱发AP，AP阈值在假手术组为-34.8 ± 2.3 mV（n = 15），IoN-CCI组显著降低至-42.4 ± 1.5 mV（n = 15）。AP幅度（假手术组85.4 ± 3.8 mV，IoN-CCI组91.6 ± 2.8 mV）、AP基强度（rheobase）、AP时程（假手术组0.57 ± 0.03 ms，IoN-CCI组0.61 ± 0.03 ms）、AP去极化速率（positive dV/dt peak）和复极化速率（negative dV/dt peak）在两组间均无显著差异。窄AP时程与两类神经元的分类一致。

4. 非伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的被动膜特性变化

非伤害性样Aβ传入TG神经元的胞体直径（假手术组32.4 ± 0.5 μm，n = 15；IoN-CCI组33.5 ± 0.7 μm，n = 15）、膜电容（Cm）、静息膜电位（RMP）和输入电阻（Rm）在假手术组与IoN-CCI组之间均无显著差异。

5. 非伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的电压激活电流变化

电压钳记录显示，去极化电压阶跃在两类神经元中均诱发瞬时内向电流（由电压门控Na⁺通道介导）随后出现外向电流（由K⁺通道介导）。IoN-CCI组非伤害性样Aβ传入TG神经元的电压激活内向电流（Na⁺电流）显著大于假手术组。同样，外向电流的早期相和晚期相在IoN-CCI组也显著大于假手术组。

6. 伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的活性膜特性变化

伤害性样Aβ传入TG神经元具有AP时程> 1 ms的缓慢AP波形。传入CV在假手术组为10.3 ± 0.2 m/s，IoN-CCI组为10.7 ± 0.3 m/s，无显著差异。两组均未观察到自发性AP。AP阈值在假手术组为-27.6 ± 2.3 mV（n = 6），IoN-CCI组显著降低至-33.9 ± 1.50 mV（n = 6）。AP幅度（假手术组111.4 ± 2.2 mV，IoN-CCI组116.4 ± 0.8 mV）、AP基强度、AP时程（假手术组1.34 ± 0.08 ms，IoN-CCI组1.23 ± 0.08 ms）和复极化速率在两组间均无显著差异。AP去极化速率（positive dV/dt peak）在假手术组为182.8 ± 12.4 mV/ms（n = 6），IoN-CCI组显著增加至230.7 ± 10.1 mV/ms（n = 6）。

7. 伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的被动膜特性变化

伤害性样Aβ传入TG神经元的胞体直径（假手术组32.6 ± 0.1 μm，n = 6；IoN-CCI组33.3 ± 0.6 μm，n = 6）、膜电容（Cm）、静息膜电位（RMP）和输入电阻（Rm）在假手术组与IoN-CCI组之间均无显著差异。

8. 伤害性样Aβ传入TG神经元在IoN-CCI后的电压激活电流变化

IoN-CCI组伤害性样Aβ传入TG神经元的电压激活内向电流（Na⁺电流）显著大于假手术组。同样，外向电流的早期相和晚期相在IoN-CCI组也显著大于假手术组。

五、讨论与结论

本研究的主要电生理发现是IoN-CCI后非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元的AP阈值均显著降低，表明Aβ传入TG神经元兴奋性增强。非伤害性Aβ传入被认为在病理条件下将无害机械输入中继至伤害性通路，从而诱导机械性痛觉超敏；本研究观察到的非伤害性样Aβ传入TG神经元兴奋性增强可能驱动更强的输入进入伤害性通路，从而促进高机械敏感性。另一方面，伤害性Aβ传入兴奋性增加可能将这些高阈值机械感受器转化为低阈值机械感受器，使其能够响应触觉刺激，从而促进机械性痛觉超敏。与脊髓躯体感觉系统中的研究结果一致，伤害性Aβ传入兴奋性增强已被认为参与脊神经损伤和组织炎症后的机械性痛觉超敏。本研究未观察到Aβ传入TG神经元的自发性AP放电，尽管眼眶收紧提示IoN-CCI动物存在自发性疼痛。这一发现可能提示Aβ传入TG神经元不参与三叉神经损伤后的自发性疼痛，或者离体TG标本中支持自发性AP产生的组织环境发生改变，导致本研究无法检测到Aβ传入TG神经元中的自发性AP。

两类Aβ传入神经元在IoN-CCI后均观察到电压激活Na⁺电流密度显著升高，提示三叉神经损伤后电压门控Na⁺通道上调。既往研究已在慢性压迫背根神经节的小鼠小直径DRG神经元中观察到电压激活Na⁺电流增加，被认为促进伤害性神经元过度兴奋从而导致神经病理性疼痛。非伤害性Aβ传入神经元中表达多种电压门控Na⁺通道亚型（包括Nav1.1、Nav1.6和Nav1.7），伤害性Aβ传入神经元中除上述亚型外还高表达Nav1.8。未来研究需明确非伤害性样和伤害性样Aβ传入神经元中哪些电压门控Na⁺通道亚型上调，以解释三叉神经损伤后的神经病理性疼痛。本研究还观察到IoN-CCI组电压门控K⁺电流密度较假手术组增加，与既往慢性压迫DRG研究结果一致。增强的电压激活K⁺电流可能代表一种代偿机制，以限制三叉神经损伤后Aβ传入神经元的过度兴奋程度。

研究结论： 本研究建立了IoN-CCI口面部神经病理性疼痛小鼠模型，证明了口面部机械性痛觉超敏和自发性疼痛行为的存在，并进一步证明口面部神经病理性疼痛伴随非伤害性样和伤害性样Aβ传入TG神经元兴奋性增强，且两类神经元的电压门控Na⁺电流均显著增强。研究结果提示，Aβ传入三叉神经的兴奋性增强可能参与三叉神经损伤后口面部神经病理性疼痛的发生。