《Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids》：Bacterial extracellular vesicles in the microbiota-gut-brain axis: biogenesis, cargo, delivery, and neuromodulatory functions
细菌胞外囊泡（BEVs）是微生物群-肠-脑轴（MGBA）的潜在介导者。这些膜包裹的纳米颗粒保护其分子货物免受胃肠道和全身性降解，使生物活性信号能够在远处部位发挥作用并可能影响中枢神经系统（CNS）。本综述涵盖BEVs的生物发生及其环境调控、其神经活性货物的组成、其到达CNS的推定途径，以及其在支持稳态或驱动神经退行性变中的相反作用。研究人员还讨论了工程化BEVs平台作为CNS靶向治疗的前景和当前局限。总之，BEVs在肠-脑交流中作为货物定义、情境依赖的信使发挥作用。
**INTRODUCTION**
肠-脑交流涉及免疫、迷走、神经内分泌和代谢通路，统称微生物群-肠-脑轴（MGBA）。动物研究提示微生物群参与血脑屏障（BBB）发育和小胶质细胞稳态，微生物群改变与神经精神疾病模型中的行为及代谢变化相关。人体研究和系统综述将肠道菌群失调与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、孤独症谱系障碍（ASD）和重性抑郁障碍（MDD）联系起来。既有研究多关注可溶性代谢物或完整微生物细胞，而BEVs提供了另一条潜在通讯路径。BEVs由革兰阴性菌和革兰阳性菌释放，常见大小为数十至数百纳米，其脂双层可保护相关货物，但稳定性取决于囊泡组成和环境条件。生物学活性取决于产生菌株、货物、暴露方式和宿主状态。部分共生菌来源BEVs在实验模型中支持屏障完整性和免疫调节，另一些则含促炎脂多糖（LPS）、毒力因子或与组织损伤相关的货物。本文采用“货物-递送-功能”框架，以囊泡生物发生作为异质性来源，评估直接CNS递送与外周免疫、代谢和迷走信号，并区分肠道常驻细菌证据与口腔致病共生菌或哺乳动物EVs证据。
**CLASSIFICATION AND BIOGENESIS OF BEVs**
BEVs生物发生受细菌细胞包膜塑造。常见类别包括革兰阴性菌的外膜囊泡（OMVs）、爆炸性外膜囊泡（EOMVs）和外-内膜囊泡（OIMVs），以及革兰阳性菌的细胞质膜囊泡（CMVs）。这些类别描述膜来源、拓扑结构和生物发生特征。
**OMV biogenesis in Gram-negative bacteria**
经典OMVs经外膜向外出芽形成，机制包括Braun脂蛋白（Lpp）-肽聚糖（PG）连接局部减弱、周质中PG片段或错误折叠蛋白积累，以及VacJ/Yrb ATP结合盒（ABC）系统所致磷脂转运改变。脂质A重塑和OmpA-PG附着减少也可促进膜弯曲和释放。在大肠杆菌中，YdcZ与YdiH和BssR相互作用调控囊泡形成和选择性蛋白装载；在费氏弧菌中，鞘化鞭毛旋转促进OMV释放，提示机械贡献。不同途径可在同一菌群中共存，增加将特定货物和功能归因于单一囊泡亚群的难度。
**Explosive lysis and double-bilayer vesicles**
除有序出芽外，噬菌体来源内溶素可触发爆炸性裂解，释放的膜片段可重新组装为囊泡。OIMVs含外膜和内膜并可包裹细胞质物质，已在淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中观察到，双膜突出在淋病奈瑟菌中被直接可视化。因此双膜拓扑本身不能确定爆炸性裂解来源，这些途径对肠道囊泡池的相对贡献仍未知，密度梯度和尺寸排阻纯化不足以可靠判定生物发生亚型。MISEV2023纳入细菌EVs，但亚型判定需要菌株和制备特异的结构证据。
**CMV biogenesis in Gram-positive bacteria**
革兰阳性菌厚PG层曾被认为阻止囊泡释放，但CMVs已从金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和干酪乳酪杆菌中分离。自溶素介导的PG水解促进穿越细胞壁，金黄色葡萄球菌Sle1为例；酚溶性调节蛋白（PSMs）促进膜重塑和囊泡释放，PSM缺陷突变体在 studied conditions 中产量降低；原噬菌体编码的holin-endolysin系统也可通过细胞壁损伤促进囊泡化。枯草芽孢杆菌中内溶素形成开口允许细胞质膜突出和囊泡释放，随后膜失败和细胞死亡。各机制相对贡献取决于菌株和生长条件。
**Environmental regulation of vesicle production in the gut niche**
囊泡产生并非固定组成性过程，而动态响应环境线索。抗生素暴露、营养限制、氧化和包膜应激、温度变化及宿主免疫压力可改变OMV产生率、尺寸分布和货物装载偏好。例如半胱氨酸或其他必需氨基酸剥夺刺激脑膜炎奈瑟菌和弗朗西斯菌囊泡产生，过氧化氢和氧张力升高促进铜绿假单胞菌和脑膜炎奈瑟菌OMV释放，抗菌肽包括多黏菌素样肽可诱导囊泡化作为包膜应激适应。温度影响因菌种而异；金黄色葡萄球菌中温度改变EV丰度、大小及蛋白和RNA货物。亚抑菌浓度头孢他啶增加鲍曼不动杆菌膜囊泡形成，庆大霉素增加易感肠外致病性大肠杆菌OMV丰度并改变囊泡蛋白组成。胃肠道沿头尾轴pH、胆盐、氧张力和抗菌肽梯度对常驻微生物群施加选择压力；宿主样pH、二价阳离子和抗菌暴露变化影响沙门菌OMV产生、大小和脂质组成。但这些梯度如何塑造单个肠道共生菌和致病共生菌原位囊泡化行为仍待探索，未来需微流控肠芯片和体内囊泡追踪报告体系。
**NEUROACTIVE CARGO REPERTOIRE OF BEVs**
BEVs制备含多种货物类别，包括模式识别受体（PRR）配体、神经活性代谢物、调控RNA和催化活性酶。在 bulk 制备中检测到并不证明这些组分共存于单个囊泡，因此需区分货物多样性与已证明的共包装。
**Neuroactive metabolites and biosynthetic enzymes**
BEVs制备含神经活性代谢物和相关代谢酶，提示潜在囊泡相关代谢活性。粪便来源和离体微生物群来源囊泡的代谢组和宏蛋白质组研究报告了与谷氨酰胺-谷氨酸-γ-氨基丁酸（GABA）代谢相关的神经活性代谢物和酶；GABA也在培养的Bacteroides finegoldii分离株囊泡中检测到。这些发现建立货物关联，但不证明循环囊泡内神经递质合成。代谢物注释尤其加巴喷丁样异生物信号需确认后方可解释为细菌生物合成产物。Bacteroides来源OMVs中酸性糖苷酶和蛋白酶的功能酶活性已获证明；Bacteroides可合成鞘脂并参与肠道稳态和宿主免疫调节，微生物色氨酸代谢物可影响CNS相关芳香烃受体（AhR）信号。这些代谢物的囊泡包装和远处持续产生需直接验证。
**Microbe-associated molecular patterns**
微生物相关分子模式（MAMPs）是重要免疫活性BEVs货物。革兰阴性OMVs含LPS并可向宿主细胞递送PG片段，这些组分 engagement 不同受体包括Toll样受体4（TLR4）和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1（NOD1）；所引上皮细胞研究直接证明NOD1激活。革兰阳性囊泡可含脂磷壁酸和脂蛋白 engagement Toll样受体2（TLR2）。囊泡相关呈递可改变细胞递送和受体激活，但效力取决于制备、剂量指标和靶细胞。生理条件下到达脑实质的完整BEVs数量未知。LPS制备生物活性不同，脂质A酰化和磷酸位置影响TLR4反应，不同细菌LPS不应视为功能可互换；仅 bulk 内毒素测量不能解析脂质A结构或预测全部宿主反应，结构分析和功能受体试验可补充循环LPS阳性BEVs测量。Bacteroides fragilis荚膜多糖A（PSA）是情境依赖免疫信号另一例：含PSA OMVs engagement 树突细胞TLR2并促进调节性T细胞反应和白细胞介素-10（IL-10）产生；这补充PSA参与宿主免疫成熟证据，但不证明PSA活性仅限囊泡呈递。评估BEV介导神经免疫信号需考虑配体身份、分子结构和递送情境。
**Small noncoding RNAs**
BEVs携带小非编码RNA（sRNAs），包括调控RNA和转运RNA衍生片段。部分RNA被宿主细胞摄取后保留生物活性，但货物选择和功能因菌种和制备而异。产肠毒素和非产肠毒素B. fragilis OMVs分子组成和代谢活性不同；铜绿假单胞菌OMVs向人气道上皮细胞递送sRNA并在 studied system 中减少白细胞介素-8（IL-8）分泌；口腔病原伴放线聚集杆菌OMV相关胞外RNA促进人巨噬细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）产生，小鼠给药后报告脑相关RNA信号。这些发现不应解释为完整肠源囊泡进入脑实质的证据，转移细菌RNA的丰度、宿主靶点和细胞内机制需进一步研究，包括是否依赖宿主Argonaute蛋白。
**Amyloidogenic and proteolytic cargo**
细菌淀粉样蛋白和蛋白水解毒力因子与神经退行性变潜在相关，但囊泡递送证据不同。大肠杆菌和沙门菌curli形成β-折叠丰富纤维并促进宿主淀粉样蛋白聚集；肠道细菌curli在小鼠模型中加速α-突触核蛋白聚集并加重运动损害。该研究未建立BEV依赖机制或完整囊泡向CNS递送curli，非囊泡淀粉样蛋白和外周宿主反应仍可能贡献。蛋白水解毒力因子提供更直接活性囊泡货物例子：牙龈卟啉单胞菌产生赖氨酸特异性gingipain Kgp和精氨酸特异性gingipains RgpA/RgpB，以可溶和OMV相关形式存在；AD死后脑组织检测到gingipains与tau和泛素病理相关，牙龈卟啉单胞菌攻击BALB/c小鼠中gingipain抑制减少脑细菌负荷和神经退行性改变；人体发现为关联性，小鼠实验支持该模型机制贡献，二者均未建立gingipains在人AD中因果作用或完整囊泡向脑递送。CNS外，含Fusobacterium adhesin A（FadA）的F. nucleatum OMVs在实验研究中加重类风湿关节炎，金黄色葡萄球菌囊泡诱导特应性皮炎样炎症；这些外周例子支持研究货物特异效应，但未建立相应CNS机制。
**Current limitations and the emerging role of multiomics approaches**
当前货物清单主要来自 bulk 制备和有限可培养菌种。肠道BEVs体内蛋白质组、代谢组和RNA含量，以及特定货物是否共存于单个囊泡仍待解答。分子异质性包括脂质A酰化、RNA修饰和淀粉样构象可进一步影响生物活性。单囊泡方法可解析选定货物组合，但各平台在灵敏度、特异性和通量上有限。将囊泡分析与受体宿主细胞单细胞和空间图谱结合可连接货物暴露与细胞反应，此类测量须与扰动和转运实验配对以检验因果。
**ROUTES LINKING GUT-DERIVED BEVs TO CNS RESPONSES**
肠源BEVs可能通过直接递送囊泡或货物，或经外周免疫、代谢和神经信号间接影响CNS功能。从肠腔到脑实质经循环递送需跨肠道屏障和BBB；迷走信号是肠道BEVs暴露与CNS反应另一潜在联系。需区分囊泡相关信号与已证明的完整囊泡转运。
**Traversal of the intestinal epithelial barrier**
BEVs可能经旁细胞通路或细胞摄取和转运穿越肠上皮。屏障破坏可促进通过，但无 overt 上皮损伤模型中亦研究转运。肠屏障功能障碍患者循环LPS阳性BEVs升高；B. fragilis OMVs被树突细胞摄取并诱导免疫调节反应，但不证明微皱襞细胞转胞吞为其跨上皮路线。Bacteroides thetaiotaomicron OMVs快速上皮摄取并可穿越原代肠上皮单层；另一报告研究证明体内微生物生物分子向宿主细胞转移。口服标记B. thetaiotaomicron OMVs后生物分布研究检测到最强肠外信号在肝脏。
**Systemic circulation and hepatic clearance**
进入血流后BEVs可能被单核吞噬细胞系统摄取，但BEV特异药代数据有限。腹腔注射大肠杆菌OMVs蓄积于肝、肺、脾和肾，该实验描述外源给药而非内源肠-脑递送。哺乳动物EV研究提供概念框架，但不应作为BEV特异药代测量。血浆半衰期、器官特异摄取和内源肠源BEVs脑相关分数仍量化不足。组织检测囊泡组分或标记本身不能确立完整囊泡进入脑实质。易位OMVs仍可影响远处器官；肠道致病共生菌来源OMVs在原发性硬化性胆管炎相关炎症性肠病中促进肝炎症和纤维化。
**Crossing the BBB**
BBB由紧密连接脑微血管内皮细胞组成，限制进入脑实质。候选途径或界面可能贡献CNS暴露，但其解剖位置和支持证据不同。屏障破坏为候选途径：口服牙龈卟啉单胞菌OMVs降低脑紧密连接基因表达和occludin蛋白丰度，并与NOD样受体家族pyrin结构域3（NLRP3）炎症小体激活、tau磷酸化和记忆损害相关；这些观察未确立gingipain直接切割BBB claudin-5或occludin。比较牙龈卟啉单胞菌与其OMVs发现暴露后炎症反应和组织相关信号不同；另一研究将OMV暴露与BBB功能障碍和糖原合成酶激酶3β相关tau磷酸化联系。总支持屏障功能障碍为CNS暴露可能贡献，但未解决完整囊泡、释放货物或继发炎症介质是否跨屏障。受体介导转胞吞是完整BBB候选途径，但BEV特异受体机制未完全明确；哺乳动物细胞来源EVs转运依赖囊泡来源并可全身LPS暴露后改变，非BEVs转胞吞直接证据。OmpA参与完整大肠杆菌侵入脑微血管内皮细胞，但不建立OMVs等效受体依赖通路。脉络丛是跨血-脑脊液（CSF）屏障而非BBB本身的候选途径；重复腹腔给予牙龈卟啉单胞菌OMVs后，gingipain免疫反应性在脑室周围、脉络丛和室管膜细胞检测到，但分布未识别转运实体或路径；从脉络丛毛细血管进入CSF仍需跨脉络丛上皮屏障。Cathepsin B相关应激激活蛋白激酶/c-Jun N末端激酶（SAPK/JNK）信号被牵涉OMV暴露后下游病理，但不建立转运机制。另一假说为迁移白细胞内转运即特洛伊木马机制；死后检测细菌16S核糖体RNA（rRNA）基因序列不能识别囊泡或确立该路线，信号可能反映细菌组分、完整细菌或污染；脑和三叉神经节BEV相关神经炎症变化同样未识别载体或进入路线。直接证明白细胞转运天然肠源BEVs跨BBB仍不足。机制BBB研究强调口腔致病共生菌，但肠道共生菌亦有相关证据：B. thetaiotaomicron BEVs在多细胞肠和BBB模型中研究，受体神经元细胞检测到囊泡相关信号；肠道微生物群来源制备亦在肠上皮和脑内皮转运模型中测试；定植工程化产生NanoLuc标记BEVs的B. thetaiotaomicron在远端器官包括脑产生报告活性，推进内源微生物货物递送证据，但未确立精确体内路线或连续可视化完整囊泡跨BBB；受体依赖性、转运中囊泡完整性和脑细胞类型定量递送仍待解决。转运实验还需注意标记、剂量和纯度：PKH26和DiR等亲脂染料可产生游离染料或染料衍生颗粒信号，标记货物可与囊泡分离；仅染料对照、去除游离标记、独立膜和货物报告以及细胞或超微结构定位可加强解释。实验浓缩制备可能不重现内源暴露，混合囊泡亚型和共分离物质进一步限制归因于完整OMVs。这些限制阻止将脑相关信号等同于证实囊泡进入实质。
**The vagal nerve route**
迷走神经可能传递BEV诱导肠道信号而无需跨BBB。证据主要基于Paenalcaligenes hominis EVs小鼠研究，双侧膈下迷走神经切断减轻认知损害；迷走神经切断也改变肠道运动、免疫调节和神经内分泌信号，因此结果支持迷走参与但不证明完整BEVs逆行轴突转运。幽门螺杆菌OMVs通过补体成分3-C3a受体（C3-C3aR）信号与AD相关病理联系，提出血源和迷走机制；胃感染研究提供肠-脑炎症信号额外间接支持。完整囊泡、释放货物、循环介质和神经激活相对贡献仍待解决。
**BEVs AS FUNCTIONAL MODULATORS OF CNS HOMEOSTASIS AND PATHOLOGY**
BEVs对CNS效应取决于货物组成、细菌来源、剂量、暴露途径和宿主生理状态。选定共生菌BEVs在实验模型中显示神经保护，而某些致病共生菌BEVs与屏障功能障碍、神经炎症和神经退行性改变相关。这些结果情境依赖，可能涉及直接货物递送或间接外周信号。
**Commensal BEV-mediated neuroprotection**
Akkermansia muciniphila来源胞外囊泡（AmEVs）是研究较多的具神经保护作用共生菌BEVs。肠缺血再灌注诱导术后认知功能障碍模型中，AmEVs通过TLR2/4相关信号抑制小胶质细胞激活；药理学小胶质细胞耗竭消除其报告的BBB完整性保护。早期工作显示AmEV治疗改善肠屏障功能并增加紧密连接蛋白表达。结肠炎相关认知障碍模型中，AmEVs改善肠和BBB完整性、减少海马炎症并改善行为表现；其减少过度结肠血清素同时恢复海马血清素水平，提示组织和疾病依赖调控。大蒜外泌体样纳米颗粒暴露改变A. muciniphila来源OMVs活性，改善小鼠高脂饮食相关代谢功能障碍；该代谢研究不应解释为认知获益直接证据。吸烟暴露模型中，AmEVs或外源吲哚-3-乳酸治疗与AhR依赖小胶质细胞调控相关改善认知结局；这本身不确立完整AmEVs内吲哚-3-乳酸递送。神经保护不限于Akkermansia：Lactiplantibacillus plantarum来源EV治疗减少缺血性神经元损伤并增加宿主microRNA-101a-3p（miR-101a-3p），牵涉c-Fos/转化生长因子β（TGF-β）通路；这些发现支持调控宿主microRNA信号，但不证明递送细菌囊泡包裹microRNAs。
**Pathobiont- and disease-associated BEVs effects**
口服P. hominis EVs诱导小鼠认知障碍和结肠炎；膈下迷走神经切断减轻认知缺陷而未显著减少结肠炎。标记EVs后海马异硫氰酸荧光素（FITC）信号较标记LPS更常检测到，迷走神经切断减少EV相关信号；但研究者未通过透射电镜在海马检测到完整EVs。标记相关信号支持暴露但不确立完整囊泡转运；FITC可标记随后脱离或释放的分子，不应与亲脂染料形成胶束行为混淆。结构研究鉴定P. hominis LPS中五酰化和四酰化脂质A，并发现TLR依赖活性弱于大肠杆菌LPS；这推动非LPS货物测试但不确立其对神经表型贡献。牙龈卟啉单胞菌OMV给药与小鼠海马和皮层信号、紧密连接蛋白表达降低、胶质激活、白细胞介素-1β（IL-1β）升高、tau磷酸化和NLRP3炎症小体激活相关；更广泛综述总结其全身效应。这些发现支持模型特异神经病理效应但不确立人AD囊泡原因。OMV介导肠-脑信号也被提出参与PD相关炎症，直接因果证据仍有限。两项互补研究牵涉肠源BEVs与AD相关病理：无菌App
NL-G-F小鼠中，SPF饲养供体粪便BEVs增加Aβ斑块负荷并影响小胶质细胞Aβ摄取和突触参数；APP/PS1小鼠中，长期灌胃AD患者来源粪便OMVs损害认知、增强神经炎症和Aβ产生并破坏肠屏障完整性和短链脂肪酸稳态。这些发现提示肠源BEVs制备可独立于给药活菌影响AD相关病理过程。
**Open mechanistic gaps**
若干缺口限制因果解释：许多实验使用纯化浓缩制备，内源暴露常未知；菌株、货物、分离方法和宿主状态可改变结局；制备可能含多种囊泡亚型、游离货物和共分离细菌物质。BEVs给药改变CNS表型不确立完整囊泡进入脑；外周免疫反应、屏障功能改变和神经信号可能贡献。需定义生产菌株、适当非囊泡对照、定量货物测量和完整囊泡直接追踪以区分替代解释。
**ENGINEERED BEVs AS CNS-TARGETED THERAPEUTIC PLATFORMS**
BEV策略旨在递送有益信号或抑制有害信号。工程化生产菌株可改变囊泡货物和表面性质，如lpxM/msbB缺失降低内毒性，口服产生抗原携带OMVs细菌原位给药；但免疫原性、屏障转运和CNS靶向需制剂特异验证。四组分脑膜炎球菌B群疫苗Bexsero含OMV组分，为含OMV疫苗临床先例，但其多剂肌内接种经验不能直接外推至慢性口服或静脉BEVs治疗。转化相关四挑战：第一残余免疫原性，缺失lpxM可降低脂质A介导TLR4刺激，但PG片段、脂蛋白、鞭毛蛋白和细菌DNA等仍可能免疫活性，重复治疗暴露需分别评估抗体反应、补体激活和免疫介导清除；多基因工程和合成囊泡制剂或有助控制组成，但减少一条炎症通路不确立总体安全或疗效。第二CNS选择性有限，给药BEVs可蓄积外周器官，定量脑递送未完全表征；实验疾病模型中中性粒细胞搭便车OMVs增强缺血脑组织递送，脑靶向Limosilactobacillus reuteri EVs减轻卒中后炎症，携带多柔比星和CD47靶向小干扰RNA（siRNA）的工程OMVs改善胶质母细胞瘤模型抗肿瘤反应；这些未确立跨完整BBB等效靶向或其他CNS疾病。口服原位产生OMVs工程菌提供另一途径，扩展到神经治疗需测试剂量控制、持续暴露和安全性。第三载荷相容性，细菌不能重现哺乳动物全部翻译后加工，复杂治疗蛋白有效装载和活性需直接验证；脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系来源神经营养因子（GDNF）和抗体片段并非本质上被细菌平台排除，但折叠、二硫键形成、定位和生物活性须逐构建体优化；替代包括另一表达系统生产后囊泡装载、哺乳动物EVs或合成载体。第四生产一致性和监管要求，生产、纯化和放行标准仍产品特异；囊泡大小、货物和残余免疫刺激活性变异可复杂化制备比较；近期粪便囊泡研究显示冻存和额外冻融循环后测量特征稳定，为方法学可重复性提供例子而非通用保存标准；临床开发需可重复工艺和验证效价与安全性试验，监管分类应依据产品组成、预期用途和作用机制并早期沟通。
**CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES**
BEVs是肠-脑交流潜在介导者，补充可溶性微生物代谢物和完整细菌细胞。其生物发生和货物异质，效应取决于细菌来源、剂量、途径和宿主状态。选定制备在实验模型中支持屏障功能或减轻炎症，另一些促进神经炎症或神经退行性表型，不应泛化至所有共生或致病共生囊泡。所提转运路线证据不均，尤其CNS表型改变不证明完整BEVs进入脑实质，迷走神经切断结果支持神经参与而非直接囊泡转运。当前解释受多项限制：多数研究使用分离囊泡制备，生产菌定植研究已提供肠道细菌货物远端递送证据；制备可能含混合囊泡群和非囊泡组分；bulk货物分析不能确立单个BEVs内分子共存；BBB研究包括口腔致病共生菌和选定肠道共生菌，但跨肠道菌群泛化仍无支持；完整内源BEVs跨越BBB或逆行迷走转运的实时可视化和定量仍是重大证据缺口。治疗开发中免疫原性、CNS选择性、载荷相容性和生产一致性需产品特异评估。进展需互补方法：单囊泡分析确立相关群体中货物组合；定义生产菌株、定植模型和独立膜与货物报告检验囊泡形成、递送和CNS反应联系；标准化分离、效价试验、安全评估和生产控制。这些步骤将阐明BEVs在MGBA中是因果介导者、相关生物标志物还是实验递送工具。
