《Pharmacognosy Magazine》：Protective Mechanism of Huperzine A in Sepsis-induced Endothelial Cell Damage Through Inhibition of NLRP3/Caspase-1/IL-1β Pathway Activation
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摘要
背景：石杉碱甲（Huperzine A，HupA）是一种首次从蛇足石杉（Huperzia serrata）中分离得到的天然生物碱，属于乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有生物活性高、脂溶性相对较高及分子量小的特点。
目的：本研究旨在证明HupA对脓毒症血清损伤的人脐
摘要
背景：石杉碱甲（Huperzine A，HupA）是一种首次从蛇足石杉（Huperzia serrata）中分离得到的天然生物碱，属于乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有生物活性高、脂溶性相对较高及分子量小的特点。
目的：本研究旨在证明HupA对脓毒症血清损伤的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的保护作用，并探讨其对NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路的调控机制。
材料与方法：研究人员收集并制备了脓毒症患者及健康个体的血清样本。体外培养HUVECs，随机分为空白组（正常培养）、对照组（健康血清培养）、脓毒症组（脓毒症血清培养）、低剂量HupA组（LD-HupA组，脓毒症血清+1×10?8 mol/L HupA）、中剂量HupA组（MD-HupA组，脓毒症血清+1×10?6 mol/L HupA）及高剂量HupA组（HD-HupA组，脓毒症血清+1×10?4 mol/L HupA）。采用MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，免疫荧光法检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达。实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）及内皮选择素（E-selectin）的mRNA水平。蛋白质印迹法（Western blot）定量NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白水平。
结果：空白组与对照组之间无显著差异（p > .05）。与对照组相比，脓毒症组细胞活力降低、凋亡增加、ROS表达升高，NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及E-selectin的mRNA水平升高，NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白水平亦升高（p < .05）。相反，与脓毒症组相比，LD-HupA、MD-HupA及HD-HupA组细胞活力改善、凋亡减少、ROS表达降低，上述标志物的mRNA水平及NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平均降低（p < .05），且呈剂量依赖性效应。
结论：HupA可通过抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β通路激活，保护脓毒症血清诱导的内皮细胞损伤。
论文解读：石杉碱甲通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路保护脓毒症诱导的内皮细胞损伤
一、研究背景与目的
脓毒症被定义为全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），炎症失衡是其发病机制中至关重要的病理基础。脓毒症的进展通常以大量炎症介质的释放为标志，这些介质驱动炎症级联反应，最终导致组织和器官损伤。内皮细胞作为血液与组织之间的关键连接，在脓毒症早期即可观察到其活化和损伤。在炎症刺激下，内皮细胞释放黏附分子，进一步促进白细胞的聚集。因此，探究脓毒症后内皮细胞损伤的机制对于脓毒症的治疗至关重要。
石杉碱甲（Huperzine A，HupA）是一种首次从蛇足石杉中分离得到的生物活性生物碱，是高效的胆碱酯酶抑制剂，通过高效、可逆且选择性地抑制乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）发挥治疗作用。1996年，HupA在中国被批准用于治疗阿尔茨海默病。近年来研究表明，HupA对细胞氧化应激、凋亡及炎症反应具有保护作用。已有研究发现HupA可通过调节α7烟碱型乙酰胆碱受体提高脓毒症小鼠存活率，减少促炎细胞因子及氧化应激反应程度。现有证据表明，脓毒症激活NLRP3/caspase-1/IL-1β炎症小体通路，触发炎症反应、氧化应激及内皮功能障碍。基于此，本研究利用脓毒症患者血清刺激HUVECs建立体外内皮细胞损伤模型，探讨不同剂量HupA对细胞存活、凋亡及炎症基因水平的影响，并进一步分析HupA对NLRP3/caspase-1/IL-1β通路的作用，旨在阐明HupA治疗脓毒症的潜在机制，为寻找脓毒症的新型治疗靶点和药物提供参考。
二、主要技术方法
研究人员从2023年12月至2024年3月期间，依据SIRS标准及Sepsis-3诊断标准纳入5例脓毒症患者，并从医院体检中心招募5例年龄、性别匹配的健康志愿者作为对照。采集空腹静脉血制备血清，分别混合脓毒症患者及健康志愿者血清以减少个体差异。体外培养HUVECs并分为六组：空白组、对照组、脓毒症组及低、中、高剂量HupA组。采用MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，激光共聚焦显微镜观察ROS荧光强度，qPCR检测NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及E-selectin的mRNA水平，Western blot定量NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白表达。研究经长沙市第四医院伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。
三、研究结果
石杉碱甲对脓毒症诱导的内皮细胞活力和凋亡的影响：通过MTT法及流式细胞术检测发现，空白组与对照组间无显著差异。脓毒症组细胞活力显著降低，表明脓毒症血清抑制了HUVECs的生长。HupA处理显著改善细胞活力，且呈剂量依赖性效应，在48小时时低、中、高剂量组细胞活力分别约为脓毒症组的1.18倍、1.32倍和1.51倍，同时降低了凋亡率。
石杉碱甲对脓毒症内皮细胞ROS表达的影响：通过免疫荧光检测发现，与空白组和对照组相比，脓毒症组ROS水平显著升高。HupA处理后ROS水平随浓度增加呈进行性降低，高剂量组ROS水平最低，表明HupA可剂量依赖性地降低细胞内ROS水平。
石杉碱甲对脓毒症内皮细胞基因表达的影响：通过qPCR检测发现，与空白组和对照组相比，脓毒症组NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及E-selectin的mRNA水平均显著升高。与脓毒症组相比，低、中、高剂量HupA组的上述基因相对表达水平均显著降低，且呈剂量依赖性。
石杉碱甲对脓毒症内皮细胞NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路蛋白表达的影响：通过Western blot检测发现，与空白组和对照组相比，脓毒症组NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白水平显著升高。与脓毒症组相比，低、中、高剂量HupA组的上述蛋白水平均显著降低，且呈剂量依赖性。
四、讨论与结论
本研究发现脓毒症患者血清处理导致HUVECs细胞活力下降和凋亡增加。脓毒症通过免疫激活与抑制失衡引起的全身炎症反应造成内皮细胞损伤。内皮细胞构成血管内皮的关键屏障，在受到有害刺激时发生改变，是脓毒症炎症免疫反应中的主要靶细胞和关键效应细胞。HupA处理显著增强了细胞活力并降低了凋亡率。研究还发现脓毒症患者血清增加了HUVECs中ROS的表达，而HupA处理可降低ROS水平，表明HupA是一种能够清除自由基的抗氧化剂。脓毒症期间，病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）通过Toll样受体激活NF-κB，驱动TNF-α和IL-6的产生。TNF-α增加ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达，促进白细胞浸润。本研究表明HupA通过抑制黏附分子和促炎基因表达来减轻脓毒症诱导的内皮损伤模型中的炎症反应。当细胞遇到有害刺激时，NLRP3炎症小体快速触发炎症反应，caspase-1随后将IL-1β无活性前体切割为成熟形式，加剧炎症反应并促进细胞焦亡。本研究发现HupA可降低NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达，表明HupA通过抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β信号通路保护脓毒症中的内皮细胞损伤。
研究结论：HupA能够提高脓毒症内皮细胞损伤模型的存活率并抑制细胞凋亡。HupA对脓毒症诱导的内皮损伤的保护作用可能源于其抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β通路、减少ROS积累以及降低促炎基因（NF-κB、TNF-α、IL-6）和黏附分子（ICAM-1、VCAM-1、E-selectin）水平的能力。本研究结果为理解HupA减轻脓毒症后内皮细胞损伤的机制提供了有价值的见解，并为开发脓毒症新型治疗药物提供了重要信息。
