基于Nrf2/GCLM与Bcl-2/Bax/Caspase-3通路的人参皂苷Rg3脂质体制备及其对帕金森病模型的神经保护作用研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Preparation of ginsenoside Rg3 liposomes and evaluating its protective effect on models of Parkinson’s disease

　　

人参皂苷Rg3（Gs-Rg3）是Panax ginseng C. A. Mey.的一种生物活性成分，在帕金森病（PD）中显示出神经保护潜力。然而，Gs-Rg3的治疗效能受其水溶性差和口服生物利用度低所限。本研究旨在开发人参皂苷Rg3脂质体（Rg3-Lips）并研究其对PD模型的神经保护作用及机制。Rg3-Lips采用薄膜分散法制备。体外，SH-SY5Y细胞暴露于1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP⁺）并接受Rg3-Lips处理。评估细胞活力、活性氧（ROS）、凋亡、Nrf2/GCLM和Bcl-2/Bax/Caspase-3通路分子。体内，PD小鼠接受Rg3-Lips或Gs-Rg3治疗。评估运动功能，并分析黑质和纹状体中的多巴胺能神经、凋亡、谷胱甘肽（GSH）及相关蛋白。优化后的Rg3-Lips平均粒径为170.78 nm，包封率为93.33%，Zeta电位为?1.92 mV。体外，Rg3-Lips显著提高细胞活力，降低乳酸脱氢酶（LDH）释放和ROS水平，上调核Nrf2、GCLM水平并下调Cleaved Caspase-3表达。体内，Rg3-Lips改善PD小鼠运动功能，增加黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元和纤维，减少凋亡，升高GSH水平，并调节Nrf2/GCLM和Bcl-2/Bax/Caspase-3蛋白表达，显示出优于Gs-Rg3的疗效。总之，Rg3-Lips在实验性PD模型中发挥神经保护作用，提示其在实验性PD模型中具有潜在神经保护和治疗作用。此外，Rg3-Lips较常规活性药物成分产生改善的药理作用。

研究背景：帕金森病（PD）为神经退行性疾病，人参皂苷Rg3（Gs-Rg3）是Panax ginseng C. A. Mey.的生物活性成分，具神经保护潜力，但其水溶性差、口服生物利用度低，限制疗效。脂质体（liposomes）作为药物递送系统可提高溶解度和稳定性、改善生物利用度并降低脱靶毒性。既往药动学研究提示Rg3-Lips可提高Gs-Rg3生物利用度、延长循环时间并增强药理效果。为此，研究人员制备Rg3-Lips，并在MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞及1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导C57BL/6小鼠PD模型中评价其神经保护作用及机制，意义在于改善Gs-Rg3成药性并验证其抗PD潜力。

关键技术方法（≤250字）：采用薄膜分散法制备Rg3-Lips，经单因素实验优化Rg3-脂质1:15、磷脂-胆固醇6:1、超声4 min；以粒径/Zeta电位、透射电镜（TEM）、高效液相色谱（HPLC）、透析法表征粒径、形态、包封率（EE）和释放。体外用2 mM MPP⁺处理SH-SY5Y细胞24 h，Rg3-Lips预处理6 h，检测活力、LDH、ROS、超氧化物歧化酶（SOD）、GSH、JC-1、TUNEL、Nrf2免疫荧光及Western blot。体内用雄性C57BL/6小鼠（18–25 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK（Lu）20220006），设对照、模型、Gs-Rg3、Rg3-Lips组；Gs-Rg3灌胃、Rg3-Lips腹腔注射，MPTP 30 mg/kg腹腔注射，行旷场、爬杆、转棒实验及黑质/纹状体TH免疫组化、TUNEL、GSH和Western blot。

研究结果：
3.1 Rg3-Lips的制备与表征：单因素实验显示卵磷脂/Gs-Rg3为15:1时EE最高95.68%，卵磷脂/胆固醇6:1时92.10%，超声4 min时97.16%；优化品平均粒径170.78 nm、多分散指数（PDI）0.261、Zeta电位?1.92 mV、EE 93.33%，48 h累积释放81.6%，TEM见100–200 nm球形双层结构。HPLC法特异性好，2–200 μg/mL线性R²=0.9992，精密度相对标准偏差（RSD）<2%，24 h稳定性RSD 1.88%，回收率98.50%–108.60%。通过制备表征和方法学验证得出优化处方可行、质量可控的结论。
3.2 Rg3-Lips对MPP⁺损伤SH-SY5Y细胞的影响：2 mM MPP⁺以时间依赖方式降低细胞存活，12/24/48 h显著，选24 h建模；Rg3-Lips≤10 μM对存活无显著影响，≥20 μM有细胞毒，故0–10 μM为安全范围；0.03125–0.125 μM Rg3-Lips剂量依赖恢复存活并降低LDH释放。通过MTT和LDH实验得出Rg3-Lips减轻MPP⁺细胞损伤的结论。
3.3 Rg3-Lips对SH-SY5Y细胞氧化应激的影响：MPP⁺显著升高ROS、降低SOD活性和GSH；Rg3-Lips 0.0625/0.125 μM降低ROS、提高SOD和GSH，并增强Nrf2核转位、上调核Nrf2和GCLM。通过DCFH-DA、SOD/GSH检测、免疫荧光和Western blot得出Rg3-Lips经Nrf2/GCLM增强抗氧化能力的结论。
3.4 Rg3-Lips对SH-SY5Y细胞凋亡的影响：模型组线粒体膜电位下降，TUNEL阳性细胞增多，Bcl-2/Bax比值降低，Cleaved Caspase-3升高；Rg3-Lips提高膜电位、减少TUNEL阳性细胞、上调Bcl-2/Bax并降低Cleaved Caspase-3。通过JC-1、TUNEL和Western blot得出Rg3-Lips抑制线粒体途径凋亡的结论。
3.5 Rg3-Lips对PD小鼠运动功能的影响：模型组爬杆时间延长、转棒停留时间缩短、总距离和平均速度下降；Rg3-Lips缩短爬杆时间、延长转棒时间、提高总距离和平均速度；Gs-Rg3组较模型组无显著改善。通过旷场、爬杆和转棒实验得出Rg3-Lips改善PD小鼠运动功能的结论。
3.6 Rg3-Lips对PD小鼠多巴胺能神经的影响：模型组黑质TH阳性神经元和纹状体TH阳性纤维密度显著降低；Rg3-Lips增加TH阳性神经元和纤维；Gs-Rg3未见显著减轻。通过TH免疫组化得出Rg3-Lips减轻黑质-纹状体多巴胺能神经损伤的结论。
3.7 Rg3-Lips对PD小鼠氧化应激的影响：模型组黑质核Nrf2、GCLM及黑质/纹状体GSH降低；Rg3-Lips提高核Nrf2、GCLM和GSH；Gs-Rg3组无显著变化。通过Western blot和GSH检测得出Rg3-Lips在体内激活Nrf2/GCLM、提升GSH的结论。
3.8 Rg3-Lips对PD小鼠凋亡的影响：模型组黑质凋亡细胞增多，Bcl-2/Bax降低，Cleaved Caspase-3升高；Rg3-Lips减少凋亡细胞、提高Bcl-2/Bax、降低Cleaved Caspase-3；Gs-Rg3组无显著变化。通过TUNEL和Western blot得出Rg3-Lips抑制PD小鼠黑质凋亡的结论。

讨论总结：讨论指出人参皂苷为P. ginseng主要活性成分，可调节PD相关生化标志，涉及抗氧化、改善线粒体功能障碍、阻断毒素摄取、抗炎和调节神经营养因子。Rg3-Lips在体外和体内均表现神经保护：提高细胞活力、改善多巴胺能神经元损伤和运动功能；激活Nrf2/GCLM增加GSH、减少ROS；调节Bcl-2/Bax/Caspase-3稳定线粒体、抑制凋亡；较活性药物成分显示增强药理作用。研究采用MPP⁺细胞和MPTP小鼠模型；MPP⁺细胞死亡是经典体外多巴胺能退变模型，SH-SY5Y具人神经元特征；MPTP小鼠可模拟PD临床和病理特征；旷场/爬杆/转棒和TH免疫染色用于运动及黑质-纹状体完整性评价。氧化应激是PD主要原因之一，ROS过多可氧化脂质、修饰蛋白、攻击RNA、损伤线粒体DNA；ROS/SOD/GSH及Nrf2/GCLM用于评价。MPP⁺氧化损伤可致线粒体通透孔开放和膜电位破坏；Bcl-2/Bax/Caspase-3参与凋亡。与既往游离Gs-Rg3在鱼藤酮PD模型的研究不同，差异可能与制剂和剂量有关；本研究用脂质体且剂量较低（2.5 mg/kg vs 5–20 mg/kg），以评价低剂量下脂质体优势。局限性：未评估Rg3-Lips药动学，仅据既往工作推断；未评估脑分布和血脑屏障穿透，不能明确Rg3-Lips或释放的Gs-Rg3是否到达脑靶部位；未建立氧化应激与凋亡的整合联系，未来需阐明因果关系。

研究结论翻译：总之，Rg3-Lips可通过抗氧化和抗凋亡作用改善MPP⁺诱导的细胞损伤及MPTP诱导的PD小鼠运动功能障碍。其神经保护机制为激活Nrf2/GCLM信号通路、增强抗氧化能力、减少ROS蓄积和氧化损伤，从而保护多巴胺能神经元免受氧化应激损伤；同时通过调节Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路、稳定线粒体膜电位、抑制多巴胺能神经元凋亡。这些结果证明Rg3-Lips在实验性PD模型中发挥神经保护作用，提示其在实验性PD模型中具有潜在神经保护和治疗作用。此外，Rg3-Lips较常规活性药物成分产生改善的药理作用。