《Frontiers in Pharmacology》：Cyclosporin a directly binds CCL5: a novel mechanism in SJS/TEN revealed by network pharmacology
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背景： Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/TEN）是最急性和最严重的严重皮肤不良反应，年发病率为0.4–13例/百万人，死亡率从Stevens-Johnson综合征（SJS）的<10%到中毒性表皮坏死松解症（TEN）的>40%
背景： Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/TEN）是最急性和最严重的严重皮肤不良反应，年发病率为0.4–13例/百万人，死亡率从Stevens-Johnson综合征（SJS）的<10%到中毒性表皮坏死松解症（TEN）的>40%不等，总体死亡率约为20%。环孢素A（CsA）在Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/TEN）中临床有效，但其超越钙调神经磷酸酶抑制的机制仍不清楚。
目的： 利用网络药理学识别CsA在SJS/TEN中的新型治疗靶点，并通过实验验证最有前景的候选靶点。
方法： 使用PharmMapper和SuperPred预测CsA的潜在靶点。从GeneCards和OMIM检索SJS/TEN相关基因。通过蛋白-蛋白相互作用网络、基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析共同靶点。分子对接预测结合模式。使用微量热泳动（MST）技术在体外验证关键靶点相互作用。
结果： 研究人员在CsA与SJS/TEN之间识别出22个共同靶点。网络分析突出显示了五个核心蛋白（MMP9、CASP3、CCL5、CXCR4、CYP3A4）。分子对接预测CsA与趋化因子（C-C基序）配体5（CCL5）之间具有稳定结合。关键的是，MST实验证实CsA与CCL5蛋白之间存在直接物理相互作用，解离常数（Kd）为2.7 μM。
结论： 总之，研究人员的体外实验证实了CsA与关键趋化因子CCL5之间的直接物理结合相互作用，为CsA在SJS/TEN中快速抗炎效应提供了一种新的潜在机制假说。然而，该假说需要通过基于细胞的趋化实验进行验证。
论文解读：环孢素A通过直接结合CCL5治疗SJS/TEN的新机制
一、研究背景与科学问题
Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/TEN）是最为急性和严重的皮肤不良反应，年发病率约为0.4–13例/百万人，死亡率在SJS中低于10%，在TEN中超过40%，总体死亡率约20%。该疾病主要由药物触发，以广泛的角质形成细胞凋亡和表皮脱离为特征。尽管穿孔素、颗粒酶B和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的细胞毒性作用已被充分证实，但免疫细胞如何在表皮内快速聚集并维持效应功能仍未完全阐明。趋化因子特别是C-X-C基序趋化因子配体9（CXCL9）和配体10（CXCL10）已知可招募细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）至皮肤，但RANTES在SJS/TEN发病机制中的作用研究较少。
环孢素A（CsA）是一种从真菌发酵产物中提取的11个氨基酸环状多肽，通过阻断T细胞中活化T细胞核因子（NFAT）信号通路抑制钙调神经磷酸酶，减少白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的产生，从而抑制免疫细胞的活化和增殖。CsA已在临床上用于免疫介导的炎症性皮肤病，并反复被报道对SJS/TEN治疗有效，但其在SJS/TEN中的精确作用机制仍不清楚。
趋化因子（C-C基序）配体5（CCL5），又称RANTES，于1988年首次从活化细胞中发现，是一种经典趋化因子。它通过结合三种细胞表面受体——趋化因子（C-C基序）受体1（CCR1）、受体3（CCR3）和受体5（CCR5）——介导Th1型细胞如T细胞、单核细胞和巨噬细胞向炎症部位的迁移，并通过激活下游核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路实现其生物学功能。研究表明，过度表达的CCL5在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和Graves病等自身免疫性疾病中发挥促炎作用，加剧疾病进展或复发。
研究人员假设CsA可能通过与细胞外炎症介质特别是CCL5的直接相互作用在SJS/TEN中发挥治疗作用，这一机制独立于其钙调神经磷酸酶依赖性通路。本研究采用网络药理学和分子对接技术识别CsA在SJS/TEN中的潜在精确靶点，并通过体外实验验证最有前景的候选靶点。
二、主要技术方法
研究人员从PubChem数据库获取CsA的化学结构SMILES，输入PharmMapper和SuperPred数据库预测潜在靶点，分别获得205个和141个人类蛋白，共334个人类蛋白。SJS/TEN相关靶点从GeneCards和OMIM数据库检索，整合去重后获得SJS相关基因1,211个、TEN相关基因1,333个。通过STRING数据库（高置信度阈值0.7）构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，使用Cytoscape软件（版本3.10.3）的CytoNCA插件基于Degree、Betweenness和Closeness评分筛选关键靶点。Metascape数据库用于基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。分子对接使用AutoDock Vina软件，采用半刚性对接方法，受体蛋白三维结构从PDB数据库下载，CsA三维结构从PubChem数据库获取，结合位点参考PDB（1U4L）结构中的化合物结合位点。体外验证采用微量热泳动（MST）技术，使用NanoTemper Monolith NT.115仪器，重组人CCL5蛋白购自Sino Biological（Cat. #10900-HNAE），纯度≥95%。
三、研究结果
3.1 共同靶点筛选与网络分析： 从1,211个SJS相关基因、1,333个TEN相关基因和334个CsA靶向人类蛋白中筛选出22个共同靶点，并构建网络图。基于Degree、Betweenness和Closeness中心性筛选关键靶点。
3.2 环孢素A的潜在靶点： 在22个蛋白中，蛋白修饰酶占比最大（7个蛋白，33%），其次是代谢转换酶（4个蛋白，24%）、转运蛋白（3个蛋白，14%）以及信号分子和受体（4个蛋白），其余包括信号受体、黏附分子、免疫相关蛋白等。
3.3 GO分析与KEGG分析： GO分析表明这些蛋白主要参与蛋白代谢、信号转导、催化活性调节、细胞外区域组分和氧化还原酶活性。KEGG分析显示它们参与亚油酸代谢、药物代谢、肿瘤坏死因子信号、NF-κB信号和凋亡等通路。
3.4 分子对接： 对五个核心靶点（MMP9、CCL5、CASP3、CXCR4、CYP3A4）进行分子对接，对接分数分别为?5.4 kcal/mol、?5.8 kcal/mol、?5.3 kcal/mol、?4.7 kcal/mol和?7.3 kcal/mol。尽管CYP3A4对接分数最高，但因其作为I相代谢酶主要参与药物消除而非直接介导药理学效应，且在网络中为孤立节点，与其他核心基因无拓扑连接，故被排除。排除CYP3A4后，CCL5显示出最低结合能，表明其与环孢素结合最稳定，被优先作为主要靶点进行实验验证。
3.5 微量热泳动（MST）： 分子对接结果显示环孢素稳定结合CCL5蛋白表面结构上可及的疏水口袋。MST实验证实CsA与重组人CCL5蛋白之间存在可测量的结合相互作用，解离常数（Kd）为2.7 μM，信噪比为27.3，表明两者可在生理相关浓度范围内发生直接结合。
四、讨论与结论
PPI网络筛选出的22个共同靶点及五个核心蛋白（MMP9、CASP3、CCL5、CXCR4、CYP3A4）构成涉及炎症反应、凋亡、代谢调节和组织重塑的多功能网络。MMP9与IV型胶原酶活性增强相关，参与SJS/TEN基底层的液化变性和表皮坏死溶解过程；CASP3是执行角质形成细胞凋亡的末端效应因子；CCL5和CXCR4的上调是SJS/TEN免疫细胞特别是细胞毒性CD8?T细胞和单核细胞/巨噬细胞向皮肤归巢和浸润的关键驱动因素。
关于CsA游离血浆浓度的生理相关性，口服给药后总血浆CsA约为100–400 ng/mL，其中>90%与蛋白结合，游离浓度在nM范围。然而，由于CsA的高亲脂性和大分布容积，其优先在皮肤中蓄积，银屑病患者口服治疗的表皮浓度据报道比同期谷浓度高约10倍。组织蓄积可能将炎症部位的局部游离CsA浓度提升至微摩尔范围，为测得的CsA-CCL5相互作用（Kd = 2.7 μM）提供了生理上合理的浓度窗口。
研究人员提出以下假说：环孢素可能直接结合CCL5蛋白，从而抑制CCL5介导的免疫细胞趋化和组织浸润，最终减轻药疹相关炎症反应。该假说需通过基于细胞的趋化实验验证。在对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤研究中发现血清和肝脏CCL5水平均升高，CCL5可通过结合CCR1和CCR5配体激活MAPK和NF-κB通路，提示CCL5阻断是药物性肝损伤的有前景的治疗策略。已有研究确定SJS/TEN患者血清和水疱液中CCL5表达升高。
本研究存在一定局限性：生物信息学预测和联合实验仅提示可能性，靶点功能仍需进一步验证。后续工作应通过细胞模型和SJS/TEN动物模型中的基因敲低/过表达和特异性抑制剂对照实验，验证这些预测靶点作为CsA体内疗效的功能性靶点。本研究通过MST实验证实了CsA与CCL5的体外结合，但这种结合是否导致CCL5失活、增强其清除或影响其二聚化/寡聚化仍不清楚。需要细胞趋化实验直接观察CsA预孵育是否阻断CCL5对T细胞或单核细胞的趋化能力。临床相关性需进一步确认：未来研究应收集接受CsA治疗的SJS/TEN患者的系列血清、水疱液和皮肤活检样本，动态监测关键分子水平（包括CCL5、TNF-α和sFasL），并与临床反应相关联以验证这些机制在患者中的实际贡献。
结论： 本研究采用网络药理学方法绘制了环孢素A在SJS/TEN背景下的潜在靶点网络，揭示了其超越传统免疫抑制框架的多靶点、多通路治疗潜力，通过直接干预凋亡通路、趋化因子活性和代谢过程发挥作用。关键的是，研究人员的体外实验证明了CsA与关键趋化因子CCL5的直接物理结合，为解释CsA在SJS/TEN中的快速抗炎效应提供了新的潜在机制假说。这些发现不仅加深了对这一经典免疫抑制剂作用机制的理解，也为基于CCL5等新靶点开发更具针对性的SJS/TEN治疗策略提供了重要的理论基础和实验线索。
