生姜散通过抑制C5a/C5aR1介导的中性粒细胞活化及NET形成减轻急性肺损伤

《Frontiers in Pharmacology》：Shengjiang San suppresses C5a/C5aR1-mediated neutrophil activation and NET formation to alleviate acute lung injury

　　

背景：过度中性粒细胞活化和中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NET）形成促进急性肺损伤（acute lung injury，ALI）中的高炎症和肺泡毛细血管屏障破坏。C5a/C5aR1信号将补体激活与中性粒细胞迁移、Ca²⁺动员、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生和NET形成相联系。本研究考察生姜散（Shengjiang San，SJS）是否调控ALI中的这些反应，并探索候选循环成分。方法：通过气管内给予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠ALI，SJS治疗在LPS暴露前开始。评估肺损伤、屏障完整性、中性粒细胞反应、NET形成、C5a/C5aR1变化及肺转录组谱。用C5a或佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）刺激纯化小鼠中性粒细胞，以评价含SJS血清的效应。采用血清药物化学、血浆暴露分析、生物层干涉（biolayer interferometry，BLI）、分子对接和中性粒细胞实验表征阿魏酸（ferulic acid）。结果：SJS减轻肺部炎症、水肿、血管渗漏、中性粒细胞积聚和活化及NET形成，同时保护肺泡毛细血管屏障完整性。转录组分析显示，SJS组与模型组差异表达基因富集于补体激活、中性粒细胞活化和NET形成。SJS降低血浆和肺匀浆C5a浓度并降低肺C5aR1表达。在中性粒细胞中，含SJS血清显著抑制C5a刺激的中性粒细胞功能，包括迁移、Ca²⁺流、氧化爆发和NET释放，PMX205产生相似抑制模式。含SJS血清也抑制PMA诱导的NET形成。阿魏酸在血清中作为原型成分被检出并具有可测血浆暴露，与重组人C5a呈浓度依赖性结合，表观K_D为21.65 μM，并减少C5a刺激中性粒细胞中组蛋白H3瓜氨酸化（histone H3 citrullination）和NET形成。结论：SJS减轻LPS诱导的ALI并抑制C5a/C5aR1信号介导的中性粒细胞活化和NET形成。阿魏酸被鉴定为候选循环成分，可减少C5a激活的NET形成。

研究背景与问题：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）及其重症急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）以弥漫性肺部炎症和肺泡毛细血管屏障破坏为特征，死亡率高。过度中性粒细胞活化和中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NET）形成参与ALI高炎症和屏障破坏；C5a/C5aR1信号将补体激活与中性粒细胞迁移、Ca²⁺动员、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生及NET形成联系起来。生姜散（Shengjiang San，SJS）既往在脓毒症模型显示减轻肺损伤等作用，但机制主要涉及巨噬细胞、炎症因子和肠道免疫调节，尚不清楚SJS是否调控C5a/C5aR1相关中性粒细胞活化和过量NET形成，也未明确其循环成分。基于此，研究人员联合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠ALI模型、肺转录组和原代中性粒细胞功能实验，考察SJS对补体激活、中性粒细胞反应、NET形成和屏障损伤的影响，并表征含药血清成分及候选化合物；研究显示SJS预处理减轻ALI，抑制C5a/C5aR1相关中性粒细胞活化和NET形成，阿魏酸为候选循环成分，为SJS在ALI中的进一步评价提供依据。

关键技术与样本来源：研究采用气管内LPS滴注建立雄性C57BL/6J小鼠ALI模型（6–8周，20–22 g，北京维通利华），以SD大鼠（每组n=10）制备含SJS血清；开展肺组织RNA测序（GEO GSE345908）并重分析公共单细胞数据集GSE264032；原代小鼠中性粒细胞（骨髓或腹腔灌洗，纯度>90%）用于Transwell迁移、Ca²⁺与ROS流式、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）/瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，Cit-H3）免疫荧光、SYTOX Green及扫描电镜；采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）、血浆暴露分析、BLI和分子对接表征成分。

研究结果：3.1 SJS减轻LPS诱导的肺损伤与炎症反应：在LPS诱导ALI模型中，SJS预处理降低肺损伤评分、肺泡壁厚度、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）总炎性细胞和中性粒细胞数及外周血中性粒细胞比例，并降低BALF和血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平及肺组织Il1b、Tnf、Il6 mRNA和蛋白表达；结论为SJS预处理减轻肺部炎症和组织学损伤。3.2 SJS保护肺泡毛细血管屏障完整性：通过Evans blue渗漏、肺湿干重比、BALF总蛋白和ZO-1/Occludin/VE-cadherin免疫荧光，SJS降低血管渗漏、肺水肿和屏障通透性，维持连接蛋白连续分布。3.3 转录组分析识别对SJS响应的补体相关中性粒细胞活化和NET形成程序：RNA测序显示三组聚类；SJS与模型组差异基因富集于中性粒细胞活化、补体激活、炎症反应及补体和凝血级联、NET形成；C5ar1、Padi4在模型组升高、SJS后降低。3.4 SJS减少肺中性粒细胞积聚和活化：流式显示SJS降低CD45+Ly6G+CD11b+中性粒细胞比例和CD11b平均荧光强度；免疫印迹CD11b降低；免疫组化MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）降低。3.5 SJS减少肺NET形成：免疫荧光MPO/Cit-H3共定位和NET阳性面积降低；MPO-DNA复合物降低；肽酰精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）、Cit-H3蛋白降低。3.6 SJS抑制C5a/C5aR1相关中性粒细胞活化和NET形成：SJS降低血浆和肺匀浆C5a及肺C5aR1表达；单细胞数据示C5ar1主要在中性粒细胞；含SJS血清抑制C5a诱导迁移、Ca²⁺、ROS和NET，类似PMX205，且不改变凋亡。3.7 SJS还抑制PMA诱导的NET形成：PMA刺激下，含SJS血清降低MPO、NE、PAD4、Cit-H3荧光及胞外网状结构和NET面积，GSK484类似；提示抑制不限于C5a刺激。3.8 化学表征：UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定95种成分，11类；血清检出79个条目，11原型+68代谢物；原型包括阿魏酸等。3.9 阿魏酸为候选循环成分并减弱C5a诱导NET形成：血清阿魏酸0.5 h达10.3 μg/mL，4 h约1.6 μg/mL；BLI显示与重组人C5a浓度依赖性结合，表观K_D 21.65 μM；分子对接预测结合Arg27、Arg62、Lys68；原代中性粒细胞中阿魏酸降低C5a诱导Cit-H3和NET面积。

讨论部分总结：讨论指出SJS预处理减轻LPS-ALI，降低中性粒细胞积聚和NET形成，保护屏障；转录组提示补体激活、中性粒细胞活化和NET形成是SJS响应过程；动物和原代中性粒细胞支持C5a/C5aR1相关反应参与，但未证明SJS直接拮抗C5aR1；PMA结果提示也可能涉及其他NET诱导通路或共享下游信号；阿魏酸为候选循环成分，但其对整体体内疗效贡献不明，其他循环成分未系统评价；研究采用预处理模型，ALI/ARDS病因和阶段异质，需其他模型、损伤后给药和前瞻性临床评价。

研究结论翻译：SJS预处理减轻LPS诱导的ALI，伴随肺中性粒细胞积聚和NET形成减少及肺泡毛细血管屏障完整性保护。转录组分析、动物实验和原代中性粒细胞研究一致将C5a/C5aR1信号与SJS减弱的中性粒细胞活化和NET形成相联系。血清药物化学及后续体外表征进一步支持阿魏酸是SJS的候选循环成分，可减少C5a刺激后的NET形成。这些发现为SJS在ALI中的进一步评价提供依据，尤其在其抑制补体激活相关中性粒细胞反应和过度NET形成的潜力方面。