《Frontiers in Drug Discovery》：Chemical conjugation of phage endolysins with antimicrobial peptides as a strategy to generate conjugates with enhanced in vitro bactericidal activity
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多重耐药菌（multidrug-resistant, MDR）的快速传播迫切需要超越传统抗生素的替代抗菌药物。噬菌体内溶素是一类有前景的细胞壁降解酶，其活性已通过基因融合阳离子抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）得到增强（例如Ar
多重耐药菌（multidrug-resistant, MDR）的快速传播迫切需要超越传统抗生素的替代抗菌药物。噬菌体内溶素是一类有前景的细胞壁降解酶，其活性已通过基因融合阳离子抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）得到增强（例如Artilysin?型构建体）。然而，重组生产AMP-内溶素融合蛋白常面临产量低、聚集以及纯化成本高的问题。在此，研究人员提出一种模块化、可扩展的替代方案，即利用异双功能交联剂Sulfo-SMCC将重组内溶素（LysJEP8）与合成AMP（GWH1和PAD）进行产后的化学偶联。LysJEP8和两种AMP均表现出菌株依赖性的抑制活性。然而，LysJEP8–AMP偶联物显著增强了杀菌效力，提高了对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的杀灭效果，并将活性扩展至金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），而单独的LysJEP8对该菌无效。总体而言，化学内溶素-AMP偶联能够在避免基因融合关键瓶颈的同时，实现对具有增强抗菌活性组合的快速筛选，为开发应对MDR感染的下一代基于蛋白质的抗菌药物提供了一条灵活路径。
研究背景与科学问题
多重耐药菌（multidrug-resistant, MDR）的全球蔓延已成为公共卫生领域的重大威胁，亟需开发新型抗菌策略以替代日益失效的传统抗生素。在这一背景下，噬菌体衍生的内溶素（endolysins）作为一类靶向细菌细胞壁肽聚糖层的裂解酶，展现出独特的应用潜力。与传统抗生素相比，内溶素诱导耐药性的倾向较低，并可针对特定菌种进行工程化改造。然而，天然内溶素的抗菌谱往往受限：多数内溶素对革兰氏阳性菌有效，但对拥有外膜屏障的革兰氏阴性菌作用较弱。例如，来自大肠杆菌噬菌体JEP8的内溶素LysJEP8虽对某些ESKAPE病原体（如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌）有活性，却对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌无效。
为拓宽内溶素的抗菌谱，研究者曾尝试将其与膜穿透性阳离子抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）进行基因融合，构建嵌合蛋白（如Artilysin?）。尽管这一策略有效，但其瓶颈在于重组表达过程中，高度阳离子的AMP序列常导致融合蛋白折叠异常、溶解度降低、形成包涵体，进而造成产量低下和纯化成本高昂。因此，如何在不牺牲蛋白产量的前提下，高效地将内溶素与AMP结合，成为该领域亟待解决的技术难题。
研究目的与意义
本研究旨在探索一种替代传统基因融合的新策略：通过化学偶联的方法，在蛋白生产后阶段将重组内溶素LysJEP8与合成AMP（GWH1和PAD）共价连接。该策略的核心优势在于实现了组件的模块化生产和灵活组装——内溶素可通过标准重组工艺高产率制备，AMP则通过固相肽合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）批量获得，两者随后通过可控化学反应偶联成功能性复合物。这种方法有望规避基因融合带来的表达障碍，同时保持甚至增强抗菌活性，为快速筛选和开发新一代蛋白类抗菌药物提供技术平台。
主要关键技术方法
为实现上述目标，研究人员采用了一系列关键技术手段。首先，通过固定化金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC）从大肠杆菌BL21(DE3)中纯化重组LysJEP8蛋白。其次，利用异双功能交联剂Sulfo-SMCC分两步完成偶联：第一步激活LysJEP8表面的伯胺基团（赖氨酸残基），第二步与经半胱氨酸修饰的AMP（C端加Cys）的巯基反应，形成稳定的硫醚键。偶联产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）进行表征。此外，利用AlphaFold2预测LysJEP8的三维结构以鉴定溶剂可及的赖氨酸偶联位点。抗菌活性评估采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）、棋盘格法计算分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI），并通过菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）减少实验量化杀菌效力。
研究结果
3.1 LysJEP8与抗菌肽的抗菌活性
MIC测定结果显示，LysJEP8对革兰氏阴性菌呈菌株依赖性活性：对铜绿假单胞菌MIC为4 μM，对鲍曼不动杆菌为8 μM，对肺炎克雷伯菌为16 μM，但对金黄色葡萄球菌无抑制活性（MIC >32 μM）。AMP方面，GWH1对各菌株的MIC范围为8–32 μM，而PAD表现更优，对金黄色葡萄球菌MIC仅为2 μM，对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌均为4 μM。这表明各组分单独使用时活性有限且具菌株特异性。
3.2 LysJEP8与抗菌肽的协同作用评估
通过棋盘格法对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌进行评估。结果表明：对金黄色葡萄球菌未观察到协同或相加效应；对铜绿假单胞菌，两种组合均表现为相加效应（FICI >0.5且≤1）；对鲍曼不动杆菌，LysJEP8与GWH1组合在三个浓度下显示协同效应（FICI ≤0.5），LysJEP8与PAD组合在一个浓度下显示协同。进一步的CFU实验证实，LysJEP8与GWH1的非共价混合对鲍曼不动杆菌的杀菌效果显著优于单一组分，而LysJEP8与PAD的组合未见显著增强。
3.3 LysJEP8与抗菌肽的化学偶联
以牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）为模型验证了偶联流程的可行性。SDS-PAGE显示BSA-AMP偶联物分子量增加，且BSA-PAD对鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌均有适度杀菌活性，表明共价连接未使AMP失活。对LysJEP8的AlphaFold2结构预测揭示Lys59、Lys75和Lys129为最暴露的赖氨酸残基，是潜在偶联位点。LysJEP8与GWH1或PAD偶联后，SDS-PAGE呈现多条分子量递增的条带，对应携带1–3个（GWH1）或1–4个（PAD）AMP分子的不同种群，其中以1–3个AMP附着为主。
3.4 LysJEP8偶联物的特性表征
DLS测量显示，未修饰LysJEP8的平均流体动力学直径为3.6 nm，偶联GWH1或PAD后分别增至5.5 nm和5.6 nm，证实了共价附着导致的尺寸增大。CFU杀菌实验表明，偶联物显著增强了杀菌效力。对鲍曼不动杆菌，LysJEP8-PAD在0.5 μM即达到检测限，而LysJEP8-GWH1需1 μM才达相同效果，两者均远优于未修饰LysJEP8（1 μM时仅中度活性）。对金黄色葡萄球菌，LysJEP8-PAD同样在0.5 μM达到检测限，LysJEP8-GWH1也显示出比未修饰LysJEP8更强的活性。这证明偶联不仅提升了效价，还将抗菌谱成功拓展至革兰氏阳性菌。
讨论与结论
研究表明，化学偶联LysJEP8与AMP是一种可行的策略，能够显著增强内溶素的抗菌效力和拓宽其抗菌谱。与基因融合方法相比，该策略避免了蛋白溶解度和产量受损的问题，允许对肽段附着进行精确控制，维持了两组分的功能完整性。偶联产生的多价构建体（单个LysJEP8携带多个AMP）在杀菌效果上优于非共价混合物，体现了共价连接的结构优势。结论指出，该方法尤其适用于早期研发阶段的快速筛选，提供了一种灵活、经济的选择流程。在抗生素疗效持续下降的全球健康威胁背景下，这种新型蛋白类抗菌药物可作为独立疗法或与抗生素联合使用，因其作用机制不同，有望降低耐药性产生风险，为对抗MDR感染提供了极具前景的途径。
