《Chinese Medicine》：Astragali Radix–Curcumae Rhizoma synergistically potentiates 5-fluorouracil antitumor efficacy in colorectal cancer by disrupting DNA repair-cell cycle coordination
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背景：黄芪（Astragali Radix，HQ）和莪术（Curcumae Rhizoma，EZ）合称AC，是传统中医（TCM）中常用于结直肠癌（CRC）的药对。尽管AC已被用作化疗辅助剂，但其增强5-氟尿嘧啶（5-FU）疗效的分子基础仍未完全明确。方法：研究
背景：黄芪（Astragali Radix，HQ）和莪术（Curcumae Rhizoma，EZ）合称AC，是传统中医（TCM）中常用于结直肠癌（CRC）的药对。尽管AC已被用作化疗辅助剂，但其增强5-氟尿嘧啶（5-FU）疗效的分子基础仍未完全明确。方法：研究人员在HCT116异种移植小鼠模型和不同遗传背景的CRC细胞系中评估了AC单独及联合5-FU的抗肿瘤作用。使用血清生化标志物评估潜在的系统毒性。通过RNA测序分析AC诱导的转录组变化，并与网络药理学和基因表达综合库（GEO）（GSE17536、GSE17537、GSE41258、GSE20916）进行整合。通过Western blotting和免疫荧光验证关键靶点。使用CCK-8实验、Synergy Finder分析、流式细胞术和γ-H2AX染色评估细胞活力、药物相互作用、凋亡、细胞周期分布和DNA损伤。通过UPLC-QTOF-MS表征AC来源的生物可利用成分，并通过分子对接、分子动力学模拟、细胞热位移分析（CETSA）和功能验证进一步评估候选活性化合物。结果：AC在体内增强了5-FU的抗肿瘤疗效，并且在所测试条件下未加重5-FU相关的肝脏或肾脏生化毒性。体外，含AC血清提取物抑制CRC细胞活力，诱导可逆的G2/M期阻滞，并增强HCT116、CT26和HCT15细胞对5-FU的敏感性。AC处理引起有限的早期凋亡，而长时间暴露后观察到延迟凋亡，提示细胞周期阻滞是主要的早期反应。RNA-seq和整合分析显示，AC抑制与DNA复制、错配修复、核糖体生物发生和细胞周期进程相关的通路。AC下调参与细胞周期控制、DNA修复和应激生存信号的关键调节因子，包括PLK1、CDK1、CCNB1、CDC25A、c-JUN、MSH2、BRCA1和p-AKT。联合治疗进一步增加γ-H2AX积累并减少细胞周期调节蛋白。功能验证表明，c-JUN过表达部分减弱了AC介导的5-FU增敏作用，而药理性AKT抑制部分模拟了AC的增敏作用。在血清暴露成分中，去甲氧基姜黄素（Demethoxycurcumin）和山柰酚二甲醚（Kumatakenin）被鉴定为生物可利用的活性化合物，它们通过诱导G2/M期阻滞和增强5-FU的抗增殖活性部分重现了AC的作用。分子对接、分子动力学模拟和CETSA支持它们与细胞周期调节因子（尤其是CCNB1和CDK1）的靶点结合。结论：AC通过削弱DNA修复-细胞周期协调和应激生存信号来增强5-FU在CRC中的治疗疗效，从而增加5-FU诱导的DNA损伤并促进细胞周期阻滞。Demethoxycurcumin和Kumatakenin可能是这种化疗增敏作用的重要生物可利用贡献者，尽管完整的AC提取物可能通过多组分和多靶点机制发挥作用。这些发现为AC作为改善CRC基于5-FU化疗的辅助策略提供了机制支持。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）仍是全球重大健康负担，氟尿嘧啶类化疗，尤其5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），是CRC治疗的重要基石，但耐药问题严重限制长期获益。肿瘤细胞可通过DNA修复、细胞周期检查点调控及应激生存信号适应化疗压力，因此亟需增敏策略。黄芪（Astragali Radix，HQ）与莪术（Curcumae Rhizoma，EZ）合称AC，是中医治疗CRC的常用药对，但其增强5-FU疗效的分子机制尚不明确。研究人员通过体内外模型及多组学整合策略，系统阐明AC通过削弱DNA修复-细胞周期协调及应激生存信号，协同增强5-FU的抗肿瘤作用，为AC作为化疗辅助策略提供了机制基础。
在技术方法上，研究人员采用了HCT116异种移植小鼠模型，以及HCT116、CT26、HCT15三种不同遗传背景的CRC细胞系；利用RNA测序（RNA-seq）、网络药理学和GEO数据（GSE17536、GSE17537、GSE41258、GSE20916）进行整合分析；通过UPLC-QTOF-MS鉴定AC体内代谢物；并综合运用分子对接、分子动力学模拟、细胞热位移分析（CETSA）、Western blot、免疫荧光、CCK-8实验、流式细胞术及Synergy Finder药物协同分析等关键技术，从转录组、蛋白质功能、化合物-靶点结合多个层面验证了核心靶点和活性成分。
**AC在体内协同增强5-FU的抗CRC作用**：在HCT116皮下异种移植模型中，AC联合5-FU较单药显著降低肿瘤重量和体积，且血清ALT、AST、BUN、CREA水平未较5-FU单药显著升高，提示AC在增效同时未加重肝肾功能生化毒性。
**AC剂量依赖性抑制HCT116细胞活力并诱导细胞周期阻滞**：含AC血清提取物以剂量和时间依赖方式抑制HCT116细胞存活，流式细胞术显示其诱导可逆的G2/M期阻滞，早期凋亡极有限，但延长至48和72小时后凋亡增加，提示细胞周期阻滞是主要早期反应，凋亡为延迟继发事件；同时p-AKT/AKT比值降低，而Bax、Bcl-2无明显变化。
**RNA-seq分析表明抑制DNA复制、错配修复和细胞周期有助于AC的抗CRC作用**：转录组分析显示AC显著改变基因表达，下调DNA复制、错配修复、核糖体生物发生和细胞周期相关通路；与GEO中CRC患者差异基因取交集后，发现AC可逆转217个CRC中下调基因和355个CRC中上调基因的表达，富集于染色体分离和DNA复制等过程。
**根据RNA-seq分析在HCT116细胞体外验证潜在靶点**：通过蛋白质互作网络筛选出JUN、CCNB1、CDC25A、PLK1等核心基因；Western blot验证AC剂量依赖性下调PLK1、CDC25A、CDK1、CCNB1、c-JUN、MSH2和BRCA1蛋白表达，证实AC同时抑制细胞周期调控与DNA修复相关蛋白。
**AC通过下调DNA修复和细胞周期相关基因增强5-FU抗肿瘤疗效**：CCK-8与Synergy Finder证实AC含药血清与5-FU具有协同效应，联合处理显著增加γ-H2AX foci，并上调p-ATM、p-CHK2，同时下调c-Jun、CDK1、CDC25A、CCNB1和PLK1；在p53和KRAS双突变的HCT15细胞中也验证了增敏作用，说明该效应不局限于特定遗传背景。
**体内AC代谢物鉴定**：UPLC-QTOF-MS在大鼠血清、尿液和粪便中鉴定出多个可吸收的原型成分，以倍半萜类为主，另有有机酸和黄酮类；血清PLS-DA显示给药后1.5小时和4.5小时代谢谱均与对照组明显分离，多数血清代谢物在1.5小时达峰，表明AC成分可快速进入循环。
**AC中关键化合物的鉴定及其与5-FU的协同作用**：网络药理学将AC血清暴露成分的预测靶点与RNA-seq差异基因交集，获得93个重叠靶点，并结合靶点网络度筛选出前十位候选化合物；细胞功能筛选确定Demethoxycurcumin和Kumatakenin显著抑制HCT116细胞活力，SynergyFinder证实两者均与5-FU产生协同抗增殖作用。
**Demethoxycurcumin和Kumatakenin模拟AC的细胞周期阻滞效应**：两种化合物均不显著诱导早期凋亡，但剂量依赖性诱导G2/M期阻滞；免疫荧光显示其联合5-FU可有效抑制CDK1、CCNB1和CDC25A表达，在CT26细胞中也得到一致结果，说明它们部分重现了完整AC的作用。
**分子对接和分子动力学评估与CCNB1、CDK1和CDC25A的相互作用**：分子对接显示Kumatakenin与CDK1、CCNB1、CDC25A及Demethoxycurcumin与CCNB1的结合分数低于?5 kcal/mol，分子动力学模拟提示Kumatakenin与三个靶点的复合物均较稳定，Demethoxycurcumin与CCNB1结合稳定；细胞裂解液及纯化重组蛋白的CETSA进一步证实两种化合物可直接与CCNB1和CDK1结合，提高其热稳定性。
讨论部分指出，AC并非作用于单一靶点，而是协同下调PLK1、CDK1、CCNB1、CDC25A等有丝分裂核心调控模块，并抑制MSH2和BRCA1介导的DNA修复，从而阻碍细胞对5-FU所致复制应激和DNA损伤的适应。功能实验提示c-JUN下调及AKT信号抑制参与了增敏作用，但尚需更多救援实验确认因果。Demethoxycurcumin和Kumatakenin仅部分重现AC活性，完整AC可能通过多组分多靶点发挥作用。研究局限包括未直接测定DNA修复能力、未进行定量结合动力学及靶点突变验证，未来需在FOLFOX等临床方案、患者来源类器官和原位模型中进一步评估。
研究结论为：AC通过下调JUN、CCNB1、CDC25A、PLK1、CDK1、MSH2、BRCA1和p-AKT等关键调节因子，削弱DNA修复-细胞周期协调和应激生存信号，增加5-FU诱导的DNA损伤并促进细胞周期阻滞，从而增强CRC对5-FU的敏感性。Demethoxycurcumin和Kumatakenin是生物可利用的活性成分，可部分介导该增敏作用。这些发现为AC作为改善5-FU化疗效果的辅助策略提供了机制依据。
