《Parasites & Vectors》：Preliminary study on expression and functions of Toxoplasma gondii SRS67 and SRS20A proteins
编辑推荐：
背景：弓形虫（Toxoplasma gondii）表面蛋白在寄生虫入侵、增殖及宿主免疫调节中发挥关键作用，是抗弓形虫病干预的潜在靶点。SRS67与SRS20A是弓形虫表面抗原1相关序列（SRS）家族中功能尚未明确的成员，其生物学功能及对宿主的调控效应仍不清楚。
背景：弓形虫（Toxoplasma gondii）表面蛋白在寄生虫入侵、增殖及宿主免疫调节中发挥关键作用，是抗弓形虫病干预的潜在靶点。SRS67与SRS20A是弓形虫表面抗原1相关序列（SRS）家族中功能尚未明确的成员，其生物学功能及对宿主的调控效应仍不清楚。
方法：研究人员制备了重组SRS67与SRS20A蛋白，并生成相应的多克隆抗体，以探究其功能特征及保护潜力。
结果：免疫荧光分析显示，两种蛋白均以点状信号分布于寄生虫膜周围，提示其参与表面相关生物学过程。体外表型实验表明，所制备的多克隆抗体可显著抑制弓形虫对宿主细胞的入侵及胞内增殖。体内动物实验进一步显示，抗体处理可有效减轻弓形虫感染所致的小鼠病理损伤。在急性RH感染模型中，单蛋白或联合蛋白免疫可使小鼠存活率提高约60%，联合免疫可使死亡时间延迟1–2天。在慢性PRU感染中，抗体干预可使脑包囊负荷降低超过85%，并显著减轻脑膜增厚及神经元坏死。机制上，SRS67在急性感染期上调Th1型细胞因子（TNF-α、IL-18）的表达，而两种蛋白均下调IFN-γ以限制过度的免疫介导组织损伤。谷胱甘肽（GSH）水平升高提示这些蛋白参与抗氧化调节。在慢性感染期，联合免疫可协同增强超氧化物歧化酶（SOD）活性以抵抗氧化应激，IFN-γ表达下降有助于维持免疫稳态。
结论：本研究系统表征了SRS67与SRS20A的生物学功能，并证明其多克隆抗体可通过直接阻断寄生虫生物学行为及间接调节宿主免疫应答和抗氧化状态，发挥对弓形虫感染的强效抑制作用。研究结果为SRS家族蛋白的功能机制提供了新见解，并支持开发靶向SRS的抗弓形虫策略。
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫，可感染几乎所有温血脊椎动物和人类，对公共卫生和畜牧业构成持续威胁。弓形虫病临床表现高度依赖宿主免疫状态：免疫功能正常者通常无明显症状，而免疫功能低下人群则易发生弓形虫脑炎和脉络膜视网膜炎等危及生命的并发症。在畜牧生产中，弓形虫感染常导致妊娠动物流产和死胎，造成重大经济损失。目前临床治疗主要依赖乙胺嘧啶和磺胺类药物的联合应用，但存在明显毒副作用且对慢性感染疗效欠佳。因此，亟需发掘新的功能分子靶点及有效的中和策略。
弓形虫表面抗原1相关序列（SRS）蛋白是一类结构保守的膜锚定蛋白家族，与经典表面抗原SAG1具有高度同源性。SRS家族蛋白参与宿主细胞识别、黏附与入侵等核心寄生生物学过程，是寄生虫-宿主互作及感染进程的关键介导分子。已有研究表明，敲除SRS19d可显著损害寄生虫增殖、毒力和包囊形成，缺失SRS35（P18）则改变寄生虫致病表型并调节宿主免疫应答。然而，大多数SRS成员的生物学特性、感染相关功能及宿主调控机制仍缺乏系统研究，这极大限制了对弓形虫致病机制的全面认知。SRS67和SRS20A是SRS家族中研究甚少的两个表面蛋白，其亚细胞定位、核心生物学功能及感染过程中对宿主免疫和抗氧化反应的调节作用尚不清楚。
研究人员通过制备重组SRS67和SRS20A蛋白并生成相应多克隆抗体，系统表征了两种蛋白的生物学特征和亚细胞分布，并在体外和体内验证了相应多克隆抗体对弓形虫感染力的强效中和作用。通过建立急性RH株和慢性PRU株小鼠感染模型，进一步探讨了两种蛋白在不同感染阶段对宿主病理损伤、免疫应答和抗氧化稳态的调节作用。该研究旨在丰富弓形虫SRS家族蛋白的功能注释，并为开发新型抗弓形虫干预策略提供靶点资源。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：基于ToxoDB数据库设计基因特异性引物，通过分子克隆构建pET-32a重组表达质粒，在大肠杆菌BL21中经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白，经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化并逐步复性；以重组蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔制备多克隆抗血清，经ELISA检测抗体效价、Western blot验证特异性，并通过Protein A/G琼脂糖亲和层析纯化IgG；采用免疫荧光法（IFA）定位蛋白在胞外速殖子和胞内纳虫泡内寄生虫中的分布；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因在RH株和PRU株中的转录水平；通过蚀斑实验、入侵实验、增殖实验和逸出实验评估抗体的体外中和活性；建立RH急性感染和PRU慢性感染小鼠模型开展免疫保护实验，并结合组织病理学分析、脑包囊计数、精神状态评分及氧化应激与细胞因子基因表达检测。
在重组蛋白制备与抗体验证方面，经IPTG诱导表达和亲和纯化后，Western blot显示SRS67和SRS20A分别在约36.8 kDa和47.3 kDa处出现特异性条带，与理论分子量一致。免疫后BALB/c小鼠和新西兰白兔血清中针对SRS67和SRS20A的ELISA终点抗体效价均不低于1:32,000。Western blot进一步证实小鼠和兔源抗SRS67/抗SRS20A抗体能特异性结合RH株速殖子裂解液中的内源性SRS67和SRS20A，无明显交叉反应。纯化后的抗SRS67和抗SRS20A IgG浓度分别为1.36 μg/mL和2.14 μg/mL，还原性SDS-PAGE显示约55 kDa重链和约25 kDa轻链两条清晰条带。
在基因转录分析方面，ToxoDB数据库转录组数据显示SRS67在I型RH速殖子急性感染晚期（33 h）显著上调，并在慢性感染期小鼠脑包囊缓殖子中逐步升高，属于缓殖子优势基因；SRS20A则在胞外RH速殖子中达到最大转录水平，宿主细胞入侵后下调，在整个速殖子细胞周期中保持持续高表达。qRT-PCR验证显示，SRS67在PRU株中的表达显著高于RH株，而SRS20A在两种株系间的转录差异无统计学意义，证实SRS67偏向于在缓殖子倾向的PRU株中过表达，SRS20A则在两种株系的速殖子中组成性高转录。
在亚细胞定位方面，以弓形虫膜蛋白GAP45作为共定位标志，免疫荧光分析显示SRS67和SRS20A主要定位于游离速殖子和纳虫泡内速殖子的顶复合体周围，呈点状分布，与GAP45存在部分共定位，符合SRS家族蛋白的典型膜锚定特征。
在抗体体外抑制实验方面，细胞毒性实验证实抗SRS67和抗SRS20A IgG在高达100 μg/mL浓度下仍维持Vero细胞90%以上活力。蚀斑实验中，50 μg/mL和100 μg/mL抗SRS67 IgG分别使蚀斑数量减少39%和65%，抗SRS20A IgG则分别减少43%和69%。入侵实验中，100 μg/mL浓度下抗SRS67 IgG和抗SRS20A IgG分别使寄生虫入侵率降低43%和51%。增殖实验中，抗SRS67抗体使含8个速殖子的纳虫泡比例从约35%升至59%，含16个速殖子的比例从约53%降至13%；抗SRS20A抗体使含8个速殖子的比例从约35%升至57%，含16个速殖子的比例从约53%降至20%。逸出实验中，50和100 μg/mL抗SRS67 IgG分别使寄生虫逸出减少约51%和81%，抗SRS20A IgG则需100 μg/mL才能达到显著抑制。
在免疫保护实验方面，急性RH感染模型中，未免疫感染小鼠在攻虫后10天内全部死亡，单SRS67、单SRS20A或联合免疫组小鼠存活率均达60%，联合免疫组死亡时间较单蛋白免疫组延迟1–2天。慢性PRU感染模型中，感染对照组存活率为80%，而SRS67免疫组、SRS20A免疫组和联合免疫组均实现100%存活。PRU感染对照组小鼠精神状态评分低且波动大，免疫组小鼠维持较高且稳定的精神状态评分。感染对照组体重下降显著，免疫组体重减轻明显缓解并在观察后期逐渐稳定。脑包囊负荷方面，与单纯PRU感染组相比，SRS67+PRU组脑包囊数减少85.1%，SRS20A+PRU组减少93.3%，SRS67+SRS20A+PRU组减少91.7%。组织病理学分析显示，未免疫感染小鼠脑组织出现严重病理损伤，包括血管周围套袖现象、脑膜增厚、伴神经元吞噬现象的神经元坏死及脑膜下炎性浸润；各免疫组小鼠仅表现轻度炎性损伤，其中联合免疫组神经病理改变较单蛋白免疫组更轻微。
在氧化应激标志物与细胞因子基因表达分析方面，RH急性感染模型中，与RH感染组相比，SRS67单免疫组和SRS20A单免疫组的GSH和过氧化氢酶（CAT）基因相对表达水平均显著上调，SOD表达在各组间无显著差异；SRS67单免疫组的TNF-α和IL-18基因相对表达水平显著上调，SRS67和SRS20A单免疫组的IFN-γ基因表达显著下调，IL-10和IL-4表达无显著变化。PRU慢性感染模型中，与PRU感染组相比，仅SRS67+SRS20A联合免疫组的SOD基因相对表达水平显著上调，GSH和CAT表达无显著差异；SRS67单免疫组、SRS20A单免疫组和联合免疫组的IFN-γ基因表达均显著下调，IL-10、IL-4、TNF-α和IL-18表达无显著变化。
讨论部分指出，系统发育分析显示SRS67和SRS20A在弓形虫各株系间具有极高的种内保守性，同源序列一致性超过98%，遗传距离几乎为零。跨物种比较揭示了两种基因在顶复门寄生虫中的不同进化轨迹，支持“种内保守、种间分化”的典型进化模式。抗原性预测显示SRS20A拥有最多的抗原决定簇（15个）、B细胞表位（8个）、Th细胞表位（20个）和CTL表位（3个），SRS67也含有丰富的抗原基序，优于多数已测入侵相关蛋白。阶段特异性转录谱显示SRS67为缓殖子优势基因，提示其在慢性感染建立和维持中发挥关键作用；SRS20A则发挥组成性持家功能，主要参与寄生虫附着和宿主细胞入侵的基础生物学过程。亚细胞定位分析提示两种蛋白可能不仅作为膜锚定表面受体，还可能作为可溶性效应分子调节宿主-寄生虫互作。体外功能实验显示两种抗体对弓形虫入侵、增殖和逸出的抑制作用与其蛋白功能差异相对应：SRS67作为缓殖子富集蛋白对逸出过程抑制突出，SRS20A作为组成性表达表面蛋白对速殖子入侵阻断高效。体内模型进一步验证了抗体的保护功能，其机制依赖于感染阶段特异性的宿主抗氧化平衡和免疫稳态调节：急性感染期通过上调GSH增强抗氧化能力并促进Th1型细胞因子分泌以强化细胞免疫清除；慢性感染期通过联合抗体提升SOD活性抵抗氧化应激并下调过度IFN-γ表达以避免免疫介导的脑损伤。
研究结论：本研究首次系统表征了弓形虫SRS67和SRS20A的生物学特性，证实其多克隆抗体对急性和慢性弓形虫病具有中和活性，并阐明其通过调节宿主抗氧化状态和免疫应答发挥保护作用的机制。这些发现丰富了人们对SRS超家族功能多样性的认识，为开发靶向SRS的抗弓形虫策略提供了理论依据和新靶点资源。
