辣椒素通过TRPV1–SSR4蛋白相互作用抑制小胶质细胞炎症的机制研究

《Translational Neurodegeneration》：Capsaicin suppresses microglial inflammation through TRPV1–SSR4 interaction

　　

背景：瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）在神经炎症（如阿尔茨海默病等神经退行性疾病的关键病理特征）中被认为是小胶质细胞反应的重要调节因子。辣椒素作为辣椒中的主要辛辣成分，通过作为TRPV1激动剂发挥其抗炎特性。尽管辣椒素激活TRPV1通道及信号转导的机制已被广泛研究，但在神经退行性病变背景下，基于蛋白质-蛋白质相互作用的TRPV1调节小胶质细胞炎症反应的机制仍不清楚。 方法：研究人员利用脂多糖（LPS）诱导的急性神经炎症模型，检测了TRPV1激活及药理学阻断TRPV1通道门控对小胶质细胞炎症反应的影响。采用邻近标记蛋白质组学、生物发光共振能量转移（BRET）和NanoLuc双分子技术（NanoBiT）来鉴定和表征TRPV1相互作用蛋白。通过敲低信号序列受体亚基4（SSR4）以及强制TRPV1与SSR4相互作用，评估TRPV1–SSR4相互作用的功能贡献。进一步利用结构建模、基于BRET的结构域定位和共定位分析，研究SSR4被TRPV1招募的分子和亚细胞特征。 结果：在神经炎症模型中，TRPV1激动剂辣椒素以TRPV1依赖性方式减弱了促炎细胞因子的产生、神经元凋亡、小胶质细胞增生和小胶质细胞胞体增大。值得注意的是，通过辣椒卓平（capsazepine）药理学阻断TRPV1通道门控并未消除辣椒素的抗炎作用，提示存在超越经典配体门控Ca2+内流的替代机制。对TRPV1猎物蛋白的筛选和验证策略确定了SSR4是一种辣椒素响应的TRPV1相关蛋白。在小胶质细胞中敲低SSR4显著削弱了TRPV1激活引起的炎症反应抑制。相反，强制TRPV1与SSR4相互作用则部分模拟了TRPV1激活的抗炎效应。进一步的结构和细胞分析表明，TRPV1的跨膜区支持SSR4的招募。 结论：研究结果表明，辣椒素通过TRPV1–SSR4相互作用介导的机制抑制小胶质细胞炎症，这为TRPV1内感受信号传导的化学生物学基础以及天然TRPV1激动剂在修饰治疗神经炎症相关神经退行性疾病中的潜在应用提供了新的见解。

论文解读：《辣椒素通过TRPV1–SSR4蛋白相互作用抑制小胶质细胞炎症》

一、研究背景与科学问题

神经炎症是阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化等多种神经退行性疾病的共同病理特征，也是驱动疾病进展的重要因素。作为中枢神经系统的驻留免疫细胞，小胶质细胞是神经炎症反应的核心调节者，其过度或失调的活化会加剧神经元的损伤与死亡。因此，阐明控制小胶质细胞炎症性活化的分子机制，对于理解神经退行性疾病的发病机制以及开发精准的治疗策略至关重要。

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）是一种多觉型非选择性阳离子通道，可被有害热刺激、细胞外质子、辣椒素及其他内源性或外源性配体激活。辣椒素是辣椒中主要的辛辣成分，也是经典的TRPV1激动剂。近年来，TRPV1在非神经细胞（包括小胶质细胞）中的表达及其在免疫和炎症调节中的作用日益受到关注。然而，现有研究大多将TRPV1的功能归因于其Ca²⁺通道门控及下游代谢或自噬效应，其在神经退行性病变背景下调节小胶质细胞炎症反应的分子机制，尤其是基于蛋白质-蛋白质相互作用的非经典途径，仍不完全清楚。此外，TRPV1在不同病理环境下的作用似乎存在矛盾，既有促炎也有抗炎的报道，这提示可能存在更复杂的调控网络。因此，本研究旨在探究TRPV1是否通过一种依赖于蛋白质相互作用的新机制来控制小胶质细胞的炎症反应。

二、主要研究方法概述

研究人员采用了多种关键技术方法：首先，建立了脂多糖（LPS）诱导的体内外急性神经炎症模型，并结合TRPV1基因敲除小鼠和药理学工具（辣椒素、辣椒卓平）来界定TRPV1的作用。其次，利用基于嘌呤化修饰的邻近标记技术（PUP-IT）和TurboID邻近标记系统结合质谱分析，在HEK293T细胞中筛选TRPV1的潜在相互作用蛋白。随后，通过生物发光共振能量转移（BRET）、NanoLuc双分子技术（NanoBiT）和免疫共沉淀（Co-IP）等技术验证并表征了候选蛋白SSR4与TRPV1的相互作用。最后，通过siRNA敲低、雷帕霉素诱导的二聚化系统、AlphaFold3结构预测以及基于BRET的结构域作图等方法，从功能上和结构上阐明了TRPV1–SSR4轴在抑制小胶质细胞炎症中的作用。

三、研究结果

1. 辣椒素以TRPV1依赖性方式减轻LPS诱导的神经炎症

研究人员首先确认了TRPV1在原代小胶质细胞和脑组织中的表达。在体内实验中，对野生型（WT）小鼠给予LPS诱导急性神经炎症后，辣椒素处理显著降低了脑组织中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平，减少了cleaved caspase-3阳性细胞（指示神经元凋亡），并逆转了小胶质细胞的增生和胞体增大。然而，这些保护效应在TRPV1基因敲除（KO）小鼠中完全消失，表明辣椒素的抗神经炎症作用是严格依赖TRPV1的。

2. 药理学阻断TRPV1通道门控不能逆转辣椒素的抗炎效应

在体外原代小胶质细胞中，辣椒素能够部分逆转LPS诱导的小胶质细胞形态活化（如分支数和交叉点数的增加）。更重要的是，无论是在BV2小胶质细胞系还是在体内小鼠模型中，加入TRPV1通道拮抗剂辣椒卓平（capsazepine）均未能消除辣椒素降低促炎因子表达或改善小胶质细胞形态的效果。这一发现强烈提示，辣椒素的抗炎作用并非主要通过经典的TRPV1通道门控和Ca²⁺内流途径，而是存在一种非经典的作用机制。

3. 工程化邻近标记和互作筛选鉴定SSR4为候选TRPV1相互作用蛋白

为了寻找介导非经典效应的TRPV1相互作用蛋白，研究人员构建了PUP-IT和TurboID两种邻近标记系统。通过PUP-IT联合质谱分析，筛选出8个候选蛋白。进一步的钙动员实验、NanoBiT和BRET分析证实，SSR4、S100A9和HSP90AA1能与TRPV1发生物理相互作用。其中，只有SSR4与TRPV1的相互作用能被辣椒素及其类似物显著增强。免疫共沉淀实验也证实了这一点，即辣椒素增加了与TRPV1共沉淀的SSR4量。因此，SSR4被确认为一种辣椒素响应的TRPV1相关蛋白。

4. TRPV1–SSR4相互作用是小胶质细胞炎症抑制的关键

功能研究表明，在原代小胶质细胞中敲低SSR4后，辣椒素抑制LPS诱导的病理性吞噬作用和促炎因子（IL-6、IL-1β）表达的能力显著减弱甚至丧失。同时，SSR4和TRPV1的单独或联合敲低对IL-6表达的影响是非叠加性的，提示两者可能在同一通路中发挥作用。更为关键的是，通过雷帕霉素诱导的二聚化系统强制拉近TRPV1与SSR4的距离，能够部分模拟辣椒素的抗炎效果，显著降低LPS刺激下HMC3小胶质细胞中TNF-α的mRNA表达。这些互补的缺失与获得功能实验有力地证明了TRPV1–SSR4相互作用是辣椒素抑制小胶质细胞炎症的关键环节。

5. TRPV1的跨膜区域介导SSR4的招募

免疫荧光实验显示TRPV1和SSR4在内质网区域存在部分共定位，而辣椒素处理后共定位信号呈现更明显的斑点状分布。AlphaFold3结构预测提示SSR4主要与TRPV1四聚体相邻亚基之间的界面结合，其中TRPV1的跨膜区是主要的接触面。基于BRET的结构域作图进一步证实，包含跨膜区的TRPV1片段（特别是单独的跨膜区）能够产生最强的与SSR4相互作用的BRET信号，表明TRPV1的跨膜区是其招募SSR4的核心决定簇。

四、讨论与结论总结

本研究的讨论部分指出，虽然LPS诱导的小胶质细胞活化在TRPV1缺陷小鼠中仍然存在，但炎症因子水平较低，这表明TRPV1是一个调节性分子而非启动子。辣椒素的抗炎作用在TRPV1敲除背景下消失，证明了TRPV1是其发挥保护作用的必要条件。研究揭示的TRPV1–SSR4轴代表了一种新的机制，即配体结合的TRPV1可以通过蛋白质相互作用而非经典的离子传导来调节炎症输出。SSR4作为内质网转运子相关蛋白复合物的组分，可能将TRPV1信号与内质网相关的蛋白处理和炎症调控网络联系起来。结构分析初步表明，TRPV1的跨膜区是招募SSR4的核心区域。

研究结论： 本研究的发现表明，辣椒素通过TRPV1–SSR4相互作用介导的机制抑制小胶质细胞炎症，这为TRPV1内感受信号传导的化学生物学基础以及天然TRPV1激动剂在修饰治疗神经炎症相关神经退行性疾病中的潜在应用提供了新的见解。该论文发表于《Translational Neurodegeneration》。