《International Microbiology》：Metagenomic analysis of oral microbiota in Chinese children with obesity
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儿童肥胖是日益严重的全球公共卫生问题，其确切病因尚未完全阐明，可能是多因素的。除遗传和生活方式因素外，越来越多证据表明消化道微生物在肥胖发生发展中起关键作用。其中，口腔微生物群可能通过诱导全身慢性炎症和促进肠道菌群失调等机制参与肥胖。本研究中，研究人员采集9名
儿童肥胖是日益严重的全球公共卫生问题，其确切病因尚未完全阐明，可能是多因素的。除遗传和生活方式因素外，越来越多证据表明消化道微生物在肥胖发生发展中起关键作用。其中，口腔微生物群可能通过诱导全身慢性炎症和促进肠道菌群失调等机制参与肥胖。本研究中，研究人员采集9名肥胖儿童和9名正常体重儿童的唾液样本，采用宏基因组测序（metagenomic sequencing），旨在分析中国学龄期肥胖儿童口腔微生物群的结构特征和功能谱，从而从结构和功能角度全面剖析该人群口腔微生物生态。结果显示，两组微生物多样性相似。在种水平，Dialister invisus、Treponema porcinum、Moraxella sp.、Moraxella sp. VT 16 12、Moraxella lacunata和Moraxella caprae在正常体重组显著富集；相反，Campylobacter concisus、Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella rogosae、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei和Streptococcus australis在肥胖组显著富集。功能注释分析显示，与缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、β-丙氨酸代谢（beta-alanine metabolism）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路和凋亡（apoptosis）相关的功能基因在正常体重组显著富集。相反，与生物膜形成-霍乱弧菌（biofilm formation-Vibrio cholerae）、硒化合物代谢（selenocompound metabolism）、RNA聚合酶（RNA polymerase）、二甲苯降解（xylene degradation）和二噁英降解（dioxin degradation）相关的功能基因在肥胖组显著富集。相关分析进一步显示，Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei、Streptococcus australis与生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、二甲苯降解和二噁英降解功能通路呈强正相关。这些观察提示肥胖儿童口腔微生物组发生组成和功能改变，提示口腔微生物群在儿童肥胖病因学中的潜在作用。
研究背景与问题：儿童肥胖是慢性代谢性疾病，表现为全身脂肪含量过多、局部脂肪堆积增加和脂肪分布异常，近几十年来超重和肥胖人数增加且发病年龄趋于年轻化。中国肥胖人口最多，儿童肥胖已成为重要公共卫生问题。肥胖的确切病因和发病机制尚未完全阐明，遗传和环境因素存在交互作用。已有动物模型和人群研究发现肠道菌群在肥胖发病中起关键作用；口腔是消化道起点，口腔微生物群与肠道微生物群可能存在结构和功能重叠，同一个体口腔微生物群落类型与肠道微生物群落类型显著相关，因此肥胖也可能与口腔微生物群改变密切相关。已有研究提示口腔微生物失调不仅与牙周炎、龋病等局部口腔疾病有关，还可通过血流、神经通路以及吞咽和气流介导途径将炎症介质、代谢产物和细菌成分释放入全身循环，参与糖尿病、心脑血管疾病和呼吸系统疾病等。然而，聚焦口腔微生物群与儿童肥胖关联的研究仍较少；已有相关研究多基于16S rRNA基因测序，难以提供准确的种水平信息，也不能揭示口腔微生物群的功能潜力；同时口腔微生物群受民族、饮食和地理区域影响，因此需要在不同人群中开展研究。基于此，研究人员采用宏基因组测序分析中国西北地区肥胖儿童口腔微生物群特征，为后续口腔微生物群与儿童肥胖关联研究提供线索。研究人员开展的研究及结论意义：研究人员比较9例肥胖儿童与9例正常体重儿童唾液样本的口腔微生物群结构和功能，发现两组微生物多样性相似，但种水平存在差异富集菌群，功能基因谱也存在差异，肥胖组富集特定Veillonella、Streptococcus和Campylobacter concisus等物种，并富集生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、二甲苯降解和二噁英降解等功能通路；正常体重组富集HIF-1、PPAR、β-丙氨酸代谢、AMPK和凋亡相关功能基因。研究提示口腔微生物组在肥胖儿童中发生组成和功能改变，口腔微生物群可能在儿童肥胖病因学中具有潜在作用，并为儿童肥胖口腔微生物组研究提供基线数据和候选生物标志物线索。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员从中国西北甘肃省招募6–12岁儿童，按中国标准分为肥胖组（n=9）和正常体重组（n=9），采集非刺激唾液并保存于?80 °C；提取DNA并构建文库，在Illumina NovaSeq PE150平台测序；去除接头、低质量reads和宿主reads（Bowtie 2），用CD-HIT构建基因目录；以DIAMOND v0.9.9.110比对NR数据库和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）数据库进行物种与功能注释；采用Wilcoxon秩和检验、基于Bray–Curtis距离的PCoA（principal coordinate analysis，主坐标分析）和NMDS（non-metric multi-dimensional scaling，非度量多维尺度分析）、Venn图、LEfSe（linear discriminant analysis effect size，线性判别分析效应量）及差异物种-功能通路相关分析。样本队列来源为中国甘肃省。
研究结果：
1. 研究人群特征（Study population features）：通过性别和年龄匹配的肥胖组与正常体重组比较，两组性别、年龄和身高无显著差异，体重和BMI（body mass index，体质指数）存在显著差异。
2. 测序数据（Sequencing data）：18名受试者共获得804,925,436条原始测序reads，去除低质量数据和宿主污染后保留798,884,160条高质量reads，平均每样本44,382,453条，范围43,182,540–45,964,730条。
3. 组间微生物群落结构比较（Comparison of microbial community structure between groups）：通过物种分类注释、α多样性、β多样性、Venn图和LEfSe分析，共鉴定125个门、185个纲、300个目、572个科、1852个属和7459个种；门水平以Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Fusobacteria和Actinobacteria为主，肥胖组Firmicutes相对丰度升高、Bacteroidetes降低，F/B比值肥胖组较高，但差异无统计学意义；属水平Moraxella和Dialister在正常体重组显著高于肥胖组；种水平Dialister invisus、Moraxella sp.、Moraxella lacunata、Moraxella sp. VT 16 12、Moraxella caprae和Treponema porcinum在正常体重组显著富集，Campylobacter concisus、Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella rogosae、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei和Streptococcus australis在肥胖组显著富集；Venn图显示7459个种中肥胖组检测到6948种、正常体重组6734种，两组共享6223种（83.4%），肥胖组独有725种、正常体重组独有511种；Shannon指数和Simpson指数显示两组微生物多样性相似，PCoA和NMDS未发现两组群落整体差异显著。
4. 组间微生物群功能变异（Functional variation of the microbiota between groups）：通过KEGG数据库注释和差异分析，鉴定6个一级KEGG通路、231,437个注释基因，代谢通路相对丰度最高（44.5%，120,029个注释基因）；45个二级通路中翻译通路相对丰度最高（11.9%，12,736个注释基因），碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、氨基酸代谢、能量代谢、膜转运、核苷酸代谢、复制与修复通路相对丰度也较高；KEGG三级通路中相对丰度前10为核糖体、ABC转运蛋白、嘌呤代谢、群体感应、嘧啶代谢、氨酰-tRNA生物合成、同源重组、双组分系统、氧化磷酸化和错配修复；基于KEGG三级通路，共16条功能通路在两组间差异显著，肥胖组富集生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、RNA聚合酶、二甲苯降解和二噁英降解，正常体重组富集HIF-1信号通路、PPAR信号通路、β-丙氨酸代谢、AMPK信号通路和凋亡。
5. 差异物种与差异功能通路的相关性分析（Correlation analysis between differential species and differential functional pathways）：通过12个种水平差异标志物种与差异基因丰度前10的功能通路进行相关分析，Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei和Streptococcus australis与生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、二甲苯降解和二噁英降解功能通路呈强正相关。
讨论部分总结：讨论部分指出，口腔微生物组是复杂、动态且对宿主健康重要的生态系统；已有口腔微生物群与儿童肥胖关联的报道并不一致，微生物异质性可能与地理和民族差异有关。本研究未发现两组微生物多样性和群落组成显著差异，但在不同分类水平鉴定出肥胖儿童富集的多个细菌类群，可能作为未来儿童肥胖预后研究的候选生物标志物。Tam等报告肥胖个体口腔Firmicutes/Bacteroidetes比值升高，与本研究一致；Craig等应用16S rRNA基因测序分析2岁儿童口腔和肠道微生物群，观察到口腔F/B随体重增加而升高，而肠道F/B与体重增加无相关；其他研究显示6岁以上肥胖儿童和肥胖成人肠道F/B升高，原文据此提示肥胖相关口腔微生物群改变可能早于肠道微生物群改变。肥胖组富集的Veillonella和Streptococcus为口腔高丰度细菌、早期定植菌和典型共生菌，二者存在协同作用并共同参与牙菌斑生物膜形成；Veillonella可减轻过氧化氢对部分Streptococcus的抑制作用，促进链球菌生长并增强生物膜抵抗力；Streptococcus代谢碳水化合物产生有机酸，为Veillonella提供营养。Veillonella为革兰阴性厌氧球菌，与口腔炎症密切相关，可产生毒性LPS（lipopolysaccharide，脂多糖），启动牙周组织非特异性免疫反应并刺激TNF-α（tumor necrosis factor-α，肿瘤坏死因子-α）、IL-1β（interleukin-1β，白细胞介素-1β）和IL-6（interleukin-6，白细胞介素-6）等促炎细胞因子释放，触发局部牙周炎症；相关细胞因子在牙周炎患者唾液、龈沟液和血清中升高，提示牙周疾病患者可能存在局部口腔炎症和全身炎症反应。Campylobacter concisus在肥胖组显著富集，其产生的紧密连接毒素作用于肠上皮屏障，增加肠道通透性，并与儿童克罗恩病和炎症性肠病等慢性肠道疾病有关。功能注释显示两组功能基因主要分布于翻译、碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢、氨基酸代谢、能量代谢、膜转运、核苷酸代谢以及复制和修复等通路，与既往研究一致，说明这些通路是口腔微生物组的重要功能。肥胖组生物膜形成-霍乱弧菌和硒化合物代谢功能基因丰度显著升高；生物膜可保护病原菌在不利环境中存活，硒化合物具有抗炎和抗氧化等药理活性，原文认为肥胖组硒化合物代谢增强提示肥胖儿童处于慢性炎症状态；正常体重组HIF-1、PPAR、β-丙氨酸代谢、AMPK和凋亡相关功能基因丰度较高，其中HIF-1、PPAR和AMPK通路与炎症及多种代谢疾病相关，β-丙氨酸代谢与肌肉抗氧化能力和运动表现相关。相关性分析显示肥胖组富集的Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei和Streptococcus australis与生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、二甲苯降解和二噁英降解呈强正相关；Veillonella和Streptococcus作为口腔早期定植菌，在生物膜形成中的作用已被广泛研究，Streptococcus可编码糖蛋白和黏附素识别获得性薄膜蛋白受体实现定植，Veillonella作为“桥梁”附着于链球菌等初期定植菌并吸附中后期定植菌，促进生物膜形成和成熟，为口腔病原菌定植和增殖创造有利环境。原文指出二甲苯降解和二噁英降解与Streptococcus或Veillonella的关系尚未见报道，具体机制需进一步研究。局限性包括样本量较小、所有参与者来自中国西北甘肃省、性别比例不平衡和地理聚集采样降低样本代表性、横断面设计不能建立因果关系、龋齿和牙龈炎等口腔健康相关疾病及饮食和口腔卫生习惯等潜在混杂因素未系统记录、α多样性和β多样性组间无显著差异提示肥胖儿童口腔微生物组可能在种水平发生细微组成变化而非大规模群落多样性改变。
研究结论（翻译）：研究人员识别了肥胖与正常体重儿童口腔微生物群落组成和功能基因谱的差异。具体而言，Campylobacter concisus、Veillonella sp. oral taxon 158、Veillonella rogosae、Veillonella sp. S13053 19、Streptococcus ilei和Streptococcus australis在肥胖儿童口腔微生物群中显著富集。这提示这些细菌可能与儿童肥胖的发生发展相关，并可能在未来作为肥胖的候选生物标志物。此外，与生物膜形成-霍乱弧菌、硒化合物代谢、二甲苯降解和二噁英降解相关的功能基因在肥胖儿童中显著富集；肥胖儿童中增加的细菌类群也与这四条功能通路呈强正相关。总体而言，这些结果提示这四条功能通路可能是口腔细菌参与肥胖发生发展的潜在机制。本研究是对口腔微生物群与儿童肥胖关联的初步调查，为儿童肥胖口腔微生物组改变的进一步机制研究提供了基线数据。尽管如此，本研究存在若干局限。第一，样本量相对较小，所有参与者均来自中国西北甘肃省，可能限制研究结果对其他地区儿童人群的推广；此外，性别比例不平衡和地理聚集采样降低了样本代表性。未来需要扩大样本量的研究来验证初步结论。第二，横断面设计无法建立儿童肥胖与口腔微生物组之间的因果关系。第三，龋齿和牙龈炎等口腔健康相关疾病、饮食和口腔卫生习惯等潜在混杂因素未被系统记录，可能影响口腔微生物组成。最后，α多样性和β多样性在组间无显著差异，提示肥胖儿童口腔微生物组可能在种水平发生细微组成变化，而非群落多样性的大规模改变。未来需要大规模纵向研究，结合全面临床、口腔健康和宏基因组分析来验证结果。
