体外重复暴露于过氧化氢（H2O2）对念珠菌抗真菌药物敏感性、过氧化氢酶产生及生物膜形成的表型评估

《International Microbiology》：Assessment of Candida attributes under in vitro repeated exposure to hydrogen peroxide

　　

真菌感染已成为医疗保健中的重要关注问题，原因在于抗真菌耐药性(antifungal resistance)的发展以及诊断和治疗选择有限。念珠菌属(Candida species)是真菌中特别重要的一类。因此，在医疗保健环境中实施感染预防与控制(infection prevention and control, IPC)措施，如过氧化氢(H₂O₂)消毒，十分必要。鉴于现有文献表明，重复暴露于H₂O₂不会损害微生物对该消毒剂的耐受性，但在外部选择压力影响下，毒力属性(virulence attributes)的表达可能发生改变。本研究旨在通过微生物行为的表型评估(phenotypic assessment)，评价重复暴露于H₂O₂对念珠菌菌株抗真菌药物敏感性谱(antifungal susceptibility profiles)、过氧化氢酶产生(catalase production)及生物膜形成(biofilm formation)的影响。在既往研究中，C. albicans、C. parapsilosis和C. auris菌株被重复暴露于不同H₂O₂浓度，并在30天内评估其对该消毒剂的敏感性。本研究表明，重复暴露于H₂O₂仅导致C. albicans和C. parapsilosis抗真菌药物敏感性的微小波动，而未导致C. auris出现此类波动。重复暴露于H₂O₂未显示所评价物种在过氧化氢酶产生方面发生变化，也未显示生物膜形成发生改变。总之，重复暴露于H₂O₂仅导致C. albicans和C. parapsilosis菌株抗真菌药物敏感性的微小波动，表明将H₂O₂作为日常消毒剂在微生物适应性方面是安全的。然而，建议开展环境监测，以防止抗真菌耐药性的非预期发生。

真菌病原体在医疗保健相关感染中日益受到关注。真菌感染是重要公共卫生问题，主要由于抗真菌耐药性出现以及准确诊断方法和有效治疗干预的可及性有限。近期报告估计年发病650万例，死亡375万例；念珠菌属年发病可达626,000例。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将Candida spp.，包括Candida auris和Candida albicans，列为关键优先病原体。C. auris与较高发病率和死亡率相关，并对环境消毒干预具有显著耐受性；C. albicans和C. parapsilosis可在医院表面存活数周至数月。因此，感染预防与控制(infection prevention and control, IPC)措施具有重要医学意义。环境消毒策略用于降低微生物负荷及其后续传播。消毒剂通过非特异性机制发挥广谱作用，可降低靶向耐药发生风险。过氧化氢(H₂O₂)作为氧化剂产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，损伤多种必需细胞成分，延长暴露可导致微生物死亡；短雾化循环对细菌或酵母亦有效。但重复暴露于消毒剂，尤其在低浓度下，可诱导耐受甚至耐药，且毒力性状可能因H₂O₂重复暴露所致选择压力和持续氧化应激而改变；例如细菌暴露于氯己定可增强生物膜形成能力并上调外排泵基因表达。Cobrado et al.先前研究显示，重复暴露于不同浓度H₂O₂30天未导致C. albicans、C. auris和C. parapsilosis菌株最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)变化。然而，关于H₂O₂重复暴露对决定患者治疗结局的念珠菌属性，如抗真菌药物敏感性和生物膜形成能力的影响，数据仍缺乏。本研究旨在评价重复暴露于H₂O₂对念珠菌菌株抗真菌药物敏感性谱、过氧化氢酶产生和生物膜形成能力的影响。

研究人员选取C. albicans ATCC 90028和ATCC 10231、C. parapsilosis ATCC 22019和CP 009、C. auris DSMZ 21092、NCPF 8971和NCPF 8977；菌株来源包括美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、DSMZ、国家病原真菌保藏中心(National Collection of Pathogenic Fungi, NCPF)以及葡萄牙波尔图大学医学院病理系微生物学分部菌种保藏中心(CP)。按Cobrado et al.已发表方案，菌株每日暴露于?×MIC、1×MIC或2×MIC H₂O₂共30天，于第0、10、20、30天取样。采用EUCAST肉汤微量稀释法(broth microdilution assay)测定临床相关抗真菌药MIC，三重复，以第0天阳性对照归一化，>2倍稀释视为显著；采用试管法以3% H₂O₂定性检测过氧化氢酶；采用微孔板结晶紫法测定生物膜，OD₅₇₀按Stepanovic et al.标准判读，三重复。

**抗真菌药物敏感性试验（Antifungal susceptibility testing）**：通过EUCAST肉汤微量稀释法发现，阳性对照本身存在MIC变异，因此H₂O₂暴露为原因的假设被否定；C. albicans ATCC 10231在?×MIC H₂O₂暴露20天后米卡芬净MIC由0.03变为0.008 mg/L，30天后两性霉素B和卡泊芬净MIC由0.125变为0.5 mg/L，并涉及?×MIC和2×MIC暴露条件。C. parapsilosis ATCC 22019在1×MIC暴露30天后泊沙康唑MIC由0.125升至0.5 mg/L，在2×MIC暴露20和30天后由敏感0.003波动至耐药0.5 mg/L；C. parapsilosis CP 009在?×MIC暴露30天后泊沙康唑由耐药0.125转为敏感0.03 mg/L。三株C. auris对所评价抗真菌药初始敏感性值相当，重复暴露后未见变化。

**过氧化氢酶产生检测（Catalase production testing）**：通过试管法检测，所有暴露于H₂O₂的菌株在所有 designated 时间点均立即起泡，均为过氧化氢酶产生者。

**生物膜形成能力检测（Biofilm formation capability testing）**：通过微孔板结晶紫法发现，仅C. parapsilosis CP 009出现显著生物膜形成模式变化；第10天，三个H₂O₂浓度暴露菌株的生物膜形成下降，第20天较第0天基线增加。其余菌株，包括两株C. albicans、另一株C. parapsilosis及三株C. auris，均维持原生物膜特征。

讨论指出，不同环境消毒方法对特定微生物物种具有一定选择性，且持续应用消毒剂可能带来风险，因为微生物可在环境中持续存在。Cobrado et al.先前研究显示30天H₂O₂重复暴露未改变念珠菌对该消毒剂的敏感性，这与H₂O₂产生ROS可同时作用于多种细胞结构和代谢通路、不易促进耐药发展的观点一致。本研究暴露浓度低于环境消毒常用浓度，涵盖亚抑菌(?×MIC)、抑菌(1×MIC)和超抑菌(2×MIC)三种情形，可能反映H₂O₂消毒方案不规范导致杀菌剂效力受损。除消毒剂敏感性外，长期暴露还可能影响微生物特性，包括抗生素敏感性或生物膜形成、酶产生、菌落形态等毒力性状；现有研究多集中于细菌，对Candida等酵母关注不足，因此本研究提供体外视角。C. albicans和C. parapsilosis抗真菌敏感性仅微小波动，最大偏差为2倍稀释，接近阈值；C. albicans ATCC 10231在1×MIC暴露30天后两性霉素B MIC变化，原文讨论认为可能与应对H₂O₂氧化应激的过氧化氢酶产生增加有关；其卡泊芬净在?×MIC和2×MIC第30天、米卡芬净在1×MIC第20天的变化亦被讨论，既往研究显示C. albicans过氧化氢酶过表达与H₂O₂耐受增强及卡泊芬净MIC升高相关。C. parapsilosis两株的泊沙康唑MIC变化仅在30天后出现，讨论指出泊沙康唑具有延长侧链和四氢呋喃环，与靶点结合增强，其结构差异可能与该酵母反应有关；总体上，观察到的微小变异与特定H₂O₂暴露浓度或特定抗真菌类别无关，且仅在30天后出现，不能准确反映潜在耐药机制。过氧化氢酶方面，所有暴露菌株均一致产生过氧化氢酶，具有降解H₂O₂的能力；Komalapriya et al.提出细胞记忆机制可能保护微生物细胞免受后续氧化应激。生物膜方面，仅C. parapsilosis CP 009能力受损，从基线弱产生者至第10天非生物膜产生者，可能为短暂状态；C. parapsilosis具有较强黏附和形成稳固生物膜能力，结果不一致可能归因于菌株特异性生物膜特征。讨论强调，不同微生物特性可增强真菌增殖和毒力，对患者产生负面临床影响并在医疗机构持续存在；有效消毒措施减少微生物传播且不构成额外适应性选择压力。

研究结论部分翻译：总之，本研究表明，C. albicans和C. parapsilosis重复暴露于H₂O₂可诱导抗真菌药物敏感性模式的微小波动。然而，C. parapsilosis菌株在30天暴露后对泊沙康唑转为敏感表型。必须指出，暴露于该消毒剂未诱导所评价三种念珠菌的过氧化氢酶产生或生物膜形成能力发生改变。总体而言，观察到的抗真菌药物敏感性谱变化仍处于有限范围内。虽然这些变化的临床相关性仍有待阐明，但将H₂O₂作为日常消毒方案需要定期监测微生物负荷。尚需进一步研究证实这些发现；建议开展体内研究以确认这些结果。