从菲律宾马京达瑙传统发酵剂Tapay中分离乳酸菌的特性鉴定及其生物保鲜潜力

《Journal of Ethnic Foods》：Characterization of selected lactic acid bacteria from Tapay: a starter for maguindanao ethnic delicacy in Cotabato City, Philippines

　　

本研究从菲律宾马京达瑙省苏丹库达拉特市达卢芒科布地区采集的传统民族发酵剂Tapay中分离并鉴定了乳酸菌（LAB）。表型特征显示，分离株均为革兰氏阳性、不产芽孢的球菌，能够在多种环境胁迫下生长，包括宽泛的pH范围（5.0–9.0）、盐度范围（0–8% NaCl）以及中温条件（25–45 °C）。生化鉴定表明所有分离株均为同型发酵乳酸生产者。尽管大多数菌株普遍缺乏胞外α-淀粉酶和硝酸盐还原酶活性，但分离株TLB2独特地同时表现出硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性。至关重要的是，这些分离株的无细胞上清液展现出强大的抗菌效力，其作用由有机酸和细菌素等生物活性代谢物介导，有效抑制了关键食源性病原体：大肠杆菌（Escherichia coli Biotech 1634）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus Biotech 1509）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa Biotech 1335）。通过16S rRNA基因测序进行的基因型验证确认，分离株TLB2、TLB3、TLB4和TLB6与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的序列相似性为85%，这与典型耐酸、厌氧、糖发酵细菌的特征相符，此类细菌天然存在于发酵基质中。与此同时，分离株TLB1和TLB5被归类至片球菌属（Pediococcus）水平。这些发现强调了本土Tapay源乳酸菌作为功能性发酵剂用于区域食品优化和安全保障的生物保鲜潜力。

论文解读：菲律宾马京达瑙传统发酵剂Tapay中乳酸菌的特性鉴定及其生物保鲜潜力

一、研究背景与目的

传统发酵食品在亚洲社会具有重要的文化和饮食意义，其制备知识代代相传。在菲律宾南部，特别是马拉瑙族和马京达瑙族社区，“Tapay”是一种传统的发酵米制零食，代表了社区的烹饪智慧和文化传承。Tapay的生产涉及将大米煮熟后，使用当地生产的发酵剂“Tapay”进行发酵，赋予产品独特的酒香和风味。然而，决定Tapay风味和保藏特性的微生物基础，尤其是其中乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）的种类和功能，尚缺乏系统的科学阐明。先前的研究表明，Tapay发酵涉及霉菌、酵母和少量细菌的联合作用，而大蒜和辣椒等配料可能具有抑菌特性。因此，明确Tapay发酵剂中优势细菌的身份，对于理解和优化这一传统发酵过程至关重要。此外，乳酸菌作为公认安全的食品级微生物，在食品防腐中具有重要价值，它们产生的乳酸、细菌素等代谢产物能够有效抑制腐败菌和病原菌的生长。基于此，本研究旨在从菲律宾马京达瑙地区的传统Tapay发酵剂中分离、鉴定乳酸菌，并通过表型和基因型分析评估其生理特性和抗菌潜力，为其作为功能性发酵剂的应用提供科学依据。

二、研究方法概述

研究人员从菲律宾马京达瑙省苏丹库达拉特市达卢芒科布市场的不同摊位采集了5份Tapay发酵剂样品。研究采用了以下关键技术方法：1）乳酸菌分离与纯化：通过富集培养、系列稀释和双层平板法在含溴甲酚紫的MRS琼脂上进行分离，根据菌落周围黄色晕圈筛选疑似乳酸菌并进行纯化；2）表型与生化鉴定：对分离株进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、不同温度/pH/NaCl浓度下的生长耐受性测试、碳水化合物利用谱分析和淀粉水解试验；3）抗菌活性评估：采用纸片扩散法，测定分离株无细胞上清液（Cell-Free Supernatant, CFS）对四种目标病原菌——大肠杆菌（Escherichia coli Biotech 1634）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus Biotech 1509）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa Biotech 1335）的抑制作用；4）基因型鉴定：提取染色体DNA，通过PCR扩增16S rRNA基因片段并进行测序，构建最大似然法系统发育树以确定菌株的分类地位。

三、研究结果

分离与形态学鉴定：从Tapay发酵剂样品中初步筛选出6株产酸细菌。在含溴甲酚紫的MRS平板上，菌落呈乳白色，周围有黄色晕圈，表明其为产乳酸菌。显微镜观察显示所有分离株均为革兰氏阳性、不产芽孢的球菌。

生化鉴定：

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  过氧化氢酶试验：所有6株分离株均呈阴性，即不产生气泡，符合乳酸菌典型的过氧化氢酶阴性特征。
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  硝酸盐还原试验：除TLB2菌株外，其余5株均不能将硝酸盐（NO₃^?）还原为亚硝酸盐（NO₂^?）。TLB2菌株表现出硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性。
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  不同pH条件下的生长：所有分离株均能在pH 5.0–9.0范围内生长，显示出较宽的酸碱耐受性。
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  NaCl耐受性：所有分离株均能在0–8% NaCl浓度范围内生长，表明其具有较强的渗透压耐受能力。
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  温度耐受性：所有分离株均能在25–45 °C的温度范围内生长，属于中温菌。
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  碳水化合物利用：所有分离株均能发酵多种糖类且不产气（CO₂），表明其为同型发酵乳酸菌，通过糖酵解途径将糖转化为乳酸。
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  淀粉水解试验：所有分离株均未产生α-淀粉酶，无法水解淀粉。

抗菌活性评估：

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  对E. coli Biotech 1634：所有分离株均表现出抑制作用，其中TLB5的抑菌圈直径最大（9.6 mm），TLB3最小（7.3 mm），但统计上差异不显著（p > 0.05）。
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  对B. cereus Biotech 1509：所有分离株均有抑制作用，TLB5的抑菌圈最大（8 mm），TLB1最小（7 mm），统计上差异不显著（p > 0.05）。
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  对S. aureus ATCC 25923：所有分离株均能抑制该病原菌，TLB4的抑菌圈最大（9 mm），TLB5最小（7.6 mm），统计上差异不显著（p > 0.05）。
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  对P. aeruginosa Biotech 1335：所有分离株均显示出抑制活性，TLB4的抑菌圈最大（12.6 mm），TLB6最小（8 mm），统计上差异不显著（p > 0.05）。

基因型鉴定：通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，分离株TLB2、TLB3、TLB4和TLB6与标准菌株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的序列相似性为85%。分离株TLB1和TLB5被鉴定为片球菌属（Pediococcus）水平，未能精确到种。

四、结论与讨论

本研究成功从菲律宾马京达瑙传统Tapay发酵剂中分离并鉴定了6株乳酸菌。综合表型、生化和基因型分析结果，这些菌株被鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）或片球菌属成员。这些菌株具备多项理想的生理特性：它们是革兰氏阳性、不产芽孢的球菌，属于同型发酵乳酸菌，能够在较宽的pH（5.0–9.0）、盐度（0–8% NaCl）和中温（25–45 °C）条件下生长。值得注意的是，它们产生的无细胞上清液含有有机酸和细菌素等生物活性代谢物，对四种常见的食源性病原菌均表现出显著的抑制作用。

研究结论指出，从Tapay发酵剂中分离的乳酸菌，特别是戊糖片球菌，展现了作为有益微生物资源的巨大潜力。其广谱的环境耐受性和强大的抗菌活性，使其有望开发成为天然、有效的生物保鲜剂或功能性发酵剂，用于提升传统发酵食品的安全性和品质，同时也为现代食品工业寻求化学添加剂替代品提供了新的思路。这项研究不仅科学地阐释了马拉瑙族和马京达瑙族传统发酵实践背后的微生物学原理，也揭示了祖先经验智慧与现代生物保鲜技术之间的内在联系。