整合代谢组学与化学计量学揭示芹菜、芫荽和欧芹代谢物与抗多重耐药尿路致病性大肠杆菌抗菌及抗生物膜活性的关联

《BMC Complementary Medicine and Therapies》：Integrative metabolomics and chemometric analysis reveal metabolites associated with antibacterial and antibiofilm activities of celery, Coriander, and parsley against multidrug-resistant uropathogenic Escherichia coli

　　

背景：多重耐药（multidrug-resistant, MDR）尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia coli）的出现及生物膜相关感染日益流行，迫切需要新的抗菌策略。芹菜（Apium graveolens L.）、芫荽（Coriandrum sativum L.）和欧芹（Petroselinum crispum）为广泛食用的草药，具有已报道的药用特性；然而其代谢物组成与抗菌潜力之间的关系尚不充分明确。本研究探讨这些Apiaceae（伞形科）草药代谢谱差异是否与其对临床MDR尿路致病性E. coli分离株的抗菌和抗生物膜活性相关。方法：研究人员评估芹菜、芫荽和欧芹的甲醇提取物及其衍生的二氯甲烷:水（50:50, v/v）馏分对临床MDR尿路致病性E. coli的抗菌和抗生物膜活性。采用正、负离子模式下的非靶向液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-QTOF-MS/MS）代谢组学，结合多变量化学计量学分析，以表征代谢谱、区分三种草药并鉴定与所观察生物活性相关的代谢物。结果：共注释167种代谢物，包括黄酮类、香豆素类、酚酸类、脂肪酸类、二氢卟吩类（chlorins）和氨基酸衍生物。化学计量学分析根据代谢组成清晰区分三种Apiaceae物种。芫荽表现出最强抗菌活性，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为3.75 μg/mL，而所有受试提取物均显著抑制生物膜形成。代谢组学与生物活性数据的整合突出显示羟基化脂肪酸、槲皮素衍生物、香豆素类、二氢卟吩相关代谢物和eucommicin A为与抗菌和抗生物膜效应相关的候选代谢物。结论：本研究首次提供代谢组学指导的芹菜、芫荽和欧芹抗临床MDR尿路致病性E. coli分离株的整合比较。通过将代谢物特征与抗菌和抗生物膜活性相关联，研究结果为这些食用草药的生物效应植物化学基础提供新见解，并鉴定出有前景的候选物，供未来针对抗微生物耐药性和生物膜相关感染的生物测定指导及机制研究。

尿路感染（urinary tract infections, UTIs）常见，E. coli为主要尿路病原；MDR菌株增多及其生物膜形成能力导致治疗失败和复发，而常规抗生素治疗还可能破坏正常菌群。因此，寻找能抑制细菌生长并干扰生物膜形成、副作用较少的天然化合物受到关注。芹菜、芫荽和欧芹为Apiaceae食用草药，已有报道其提取物具有抗菌等潜力，但其代谢物组成与抗临床MDR尿路致病性E. coli（uropathogenic E. coli, UPEC）抗菌及抗生物膜活性之间的关系尚不充分。研究人员假设三种近缘Apiaceae草药代谢谱差异贡献其生物活性差异，并采用整合代谢组学指导策略鉴定相关代谢物。研究人员比较三种草药甲醇提取物及其二氯甲烷:水（50:50, v/v）馏分对临床MDR UPEC分离株的抗菌和抗生物膜活性，采用正负离子模式非靶向LC-QTOF-MS/MS代谢组学和多变量化学计量学分析，并将代谢组学与生物活性数据整合。结果显示，共注释167种代谢物，芫荽抗菌活性最强（MIC=3.75 μg/mL），所有受试提取物均显著抑制生物膜形成；羟基化脂肪酸、槲皮素衍生物、香豆素类、chlorins相关代谢物和eucommicin A为候选相关代谢物。该研究首次在同一分析框架内整合非靶向代谢组学、化学计量学、抗临床MDR UPEC抗菌筛选和抗生物膜评价，为三种常用Apiaceae草药的比较植物化学评价及其活性代谢物特征提供依据，并为后续生物测定指导分离和机制研究奠定基础。

关键技术方法概括（不超过250字）：植物材料购自埃及亚历山大METRO商业市场，凭证标本存放于开罗大学药学院生药学系；20株临床UPEC分离株来自埃及亚历山大私人实验室。方法包括甲醇提取及二氯甲烷:水（50:50, v/v）分馏；正负离子模式LC-QTOF-MS/MS非靶向代谢组学，MZmine、SIRIUS及KEGG数据库辅助注释；主成分分析（principal component analysis, PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis, HCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）及PLS回归；Kirby-Bauer纸片扩散法药敏试验、微量肉汤棋盘法MIC及联合评价、结晶紫微孔板生物膜测定和PCR毒力基因检测。

研究结果：（1）LC-QTOF-MS/MS分析。通过正负离子模式LC-QTOF-MS/MS注释167种代谢物，包括黄酮及黄酮苷、异黄酮、酚酸及酚苷、香豆素、氨基酸及衍生物、脂肪酸及脂质、chlorins和木脂素；芫荽黄酮和酚类最丰富，芹菜和欧芹各有特征代谢物，得出三种Apiaceae草药代谢谱明显不同。（2）黄酮及黄酮苷。通过MS/MS碎片特征（retro-Diels-Alder重排、糖基及H₂O/CO丢失）鉴定芹菜23种、芫荽21种、欧芹20种黄酮类；芹菜以apigenin conjugates为主，芫荽以quercetin conjugates为主，得出黄酮组成具种间差异。（3）酚类及酚苷。通过[M-H]^?及糖基丢失碎片鉴定芹菜11种、芫荽28种、欧芹10种酚类，芫荽含多种酚酸/酚苷，得出芫荽酚类多样性最高。（4）呋喃色酮。通过特征碎片鉴定芹菜3种、芫荽2种、欧芹11种呋喃色酮，得出欧芹富集该类成分。（5）脂肪酸和脂质。通过羟基邻近断裂、β-氢重排及头基丢失等碎片鉴定羟基化脂肪酸、脂肪酸酰胺、甘油磷脂和磺酸衍生物，得出脂类成分被系统注释。（6）Chlorins。通过丢失植二烯链、carbomethoxy等特征碎片在正离子模式鉴定约12种chlorins，得出三种草药含chlorins类。（7）氨基酸及氨基酸衍生物。通过NH₃、CH₂CO、乳酰基、乙酰基或果糖基丢失鉴定芳香氨基酸及其修饰物，得出相关衍生物被注释。（8）木脂素。通过负离子模式鉴定eucommicin A，基峰m/z 191对应quinic acid moiety，得出其在芹菜和芫荽中检出。（9）微生物学分析。通过表型鉴定20株UPEC，15/20为β溶血；Kirby-Bauer法显示全部耐阿莫西林+克拉维酸、多西环素和萘啶酸，100%敏感厄他培南、亚胺培南和美罗培南，多数为MDR；结晶紫法显示12/20强、4/20中等、4/20非生物膜形成；PCR显示fimH 80%、pap 76%、sfa约半数、afa 90%、hly 76%、cnf 35%。抗菌MIC显示芹菜总提物50 μg/mL、水母液25 μg/mL、二氯甲烷馏分无活性；芫荽总提物和水母液均3.75 μg/mL、二氯甲烷馏分100 μg/mL；欧芹总提物和水母液无活性、二氯甲烷馏分100 μg/mL；环丙沙星和诺氟沙星单用MIC 0.9–1.9 μg/mL，芫荽甲醇提取物与二者组合呈加性效应，无协同或拮抗。抗生物膜试验显示所有提取物单用或联合均显著降低生物膜质量，得出提取物具抗菌和抗生物膜潜力。（10）化学计量学分析。通过PCA、HCA和PLS-DA，负离子模式PC1和PC2分别解释50%和45%方差，三物种清晰聚类；芹菜特征为luteolin 7-O-apiosylglucoside、apiin、pyroglutamic acid、lunularic acid和1-oleoylglycerophosphoinositol，芫荽特征为quercetin 3-O-rutinoside、eucommicin A及C₁₈羟基脂肪酸，欧芹特征为fructose-phenylalanine；PLS-DA区分芹菜与欧芹R²=0.99、Q²=0.99。通过PLS回归关联代谢物与MIC，负离子模式R²cum=0.92、Q²cum=0.87，正离子模式R²cum=0.94、Q²cum=0.83，芫荽代谢物与MIC呈反向关联，欧芹接近MIC；高VIP代谢物包括quercetin 3-O-rutinoside、trihydroxy-octadecaenoic acid、hydroxy-octadecatrienoic acid、hydroxy-octadecadienoic acid、eucommicin A、furanocoumarin hexosides、methoxy-ethoxycarbonyl coumarin和13²-hydroxypheophorbide-A methyl ester，得出这些代谢物与抗菌活性相关。

讨论部分总结：提取物活性差异可能与化学组成及溶解度有关；芫荽富含quercetin、apigenin、diosmetin苷元及其共轭物、luteolin衍生物和酚类，与其强抗菌作用一致，并与Khalil等、Ali等和Ka?ániová等报道的芫荽抗菌活性一致；与Aelenei等报道的协同作用不同，本研究中芫荽与环丙沙星、诺氟沙星为加性效应。羟基化脂肪酸中羟基位于碳链中部对其抗菌性重要，芫荽富集trihydroxy-octadecaenoic acid、hydroxy-octadecatrienoic acid和hydroxy-octadecadienoic acid，可能贡献其抗菌作用；quercetin 3-O-rutinoside对革兰阴性菌等具抗菌报道。其机制可能涉及破坏微生物细胞膜、抑制微生物酶、诱导氧化应激或干扰群体感应（quorum sensing, QS）。抗生物膜方面，多酚和精油可干扰QS、抑制胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）产生和破坏细胞壁完整性；quercetin、quercetin-3-glucoside、rutin、apigenin-7-O-glucoside、luteolin、esculin、esculetin、p-coumaric acid、ferulic acid和psoralen等具抗生物膜报道。研究结论翻译：本研究通过整合非靶向LC-QTOF-MS/MS代谢组学、化学计量学分析、抗临床MDR UPEC抗菌筛选和抗生物膜评价，对芹菜、芫荽和欧芹进行了全面比较研究。共注释167种代谢物，属于多样植物化学类别，揭示三种Apiaceae草药具有不同代谢物特征。化学计量学分析成功区分提取物并鉴定贡献其化学变异和生物活性的关键代谢物。在受试提取物中，芫荽对MDR UPEC显示最强抗菌活性，而所有受试提取物均表现显著抗生物膜效应。代谢组学与生物活性数据关联突出羟基化脂肪酸、槲皮素衍生物、香豆素类、chlorins相关代谢物和eucommicin A为所观察活性的潜在贡献者。未来研究应聚焦于对整合代谢组学和生物活性分析鉴定的候选代谢物进行实验验证。最有前景的代谢物如quercetin 3-O-rutinoside、trihydroxy-octadecaenoic acid、hydroxy-octadecatrienoic acid、hydroxy-octadecadienoic acid和eucommicin A应被分离、纯化并使用 authentic standards和互补分析技术进行结构确证，随后直接评估其对MDR UPEC的抗菌和抗生物膜活性。测试单个代谢物及选定组合有助于确定观察到的效应归因于特定化合物还是多组分协同相互作用。还需进一步机制研究其对该细菌活力和生物膜形成的影响。最后，评估细胞毒性和选择性，并在合适体内UTI模型中验证最有活性候选物，将为这些候选物作为抗UPEC药物的开发潜力提供更强证据。这些研究对于确认所提出代谢物的贡献并进一步探索其在补充医学、药物开发和食品保鲜中的潜在应用是必要的。