《Molecular Biomedicine》：Lipid nanoparticle-mediated transcription factor EB mRNA delivery for the treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease
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代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种以肝脏脂质过度积累为特征的常见疾病，常进展为脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化。转录因子EB（TFEB）协调溶酶体生物发生、自噬和脂质分解代谢，因此是有潜力的治疗靶点；然而，选择性增强肝脏TFEB活性的安全直接策略仍有限。
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种以肝脏脂质过度积累为特征的常见疾病，常进展为脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化。转录因子EB（TFEB）协调溶酶体生物发生、自噬和脂质分解代谢，因此是有潜力的治疗靶点；然而，选择性增强肝脏TFEB活性的安全直接策略仍有限。在此，研究人员开发了肝靶向脂质纳米颗粒（LNPs）以递送编码野生型TFEB或组成型活性TFEB S211A突变体的mRNA，并在细胞模型及胆碱缺乏、L-氨基酸限定高脂饮食（CDAHFD）诱导的MASLD小鼠模型中评价其疗效。LNP介导的递送增加肝脏TFEB表达，增强自噬流，并将代谢通路重编程至脂肪酸氧化（如CPT1A和ACOX1），同时抑制脂肪生成基因（如FASN、ACC和SREBP1）表达。因此，靶向TFEB mRNA治疗显著降低肝脏甘油三酯含量，减轻脂肪变性，降低MASLD活动度评分，并减少纤维化重塑。机制上，转录组分析、染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）、启动子报告基因实验和靶向敲低模型表明，TFEB至少部分通过转录激活成纤维细胞生长因子21（FGF21）信号通路发挥抗脂质积累的保护作用。总之，这些发现确立LNP介导的TFEB mRNA递送作为一种用于研究肝脏生物学的有用临床前方法，并提供一种具有治疗MASLD潜力的靶向、瞬时和非整合性遗传策略。
研究背景：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种以肝细胞脂质过度积聚（>5%肝细胞）为特征的复杂病理综合征，全球约25%人群受累，可从单纯脂肪变性进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、肝硬化和肝细胞癌。其与代谢综合征、肥胖和糖尿病密切相关，增加心血管病和全因死亡风险。发病涉及过营养等环境因素与PNPLA3、TM6SF2、HSD17B13等遗传易感性的交互；肝细胞脂质过度积累引发脂毒性、加重胰岛素抵抗并促进炎症和纤维化。药物干预仍有限，选择性甲状腺激素受体β（THR-β）激动剂显示希望，PPAR激动剂、GLP-1受体激动剂和FGF类似物仍在临床评价。转录因子EB（TFEB）是MiTF/TFE家族转录调节因子，在代谢应激或营养缺乏时入核，驱动溶酶体生物发生、自噬和脂代谢基因。人肝活检中TFEB活性与脂肪变性严重度负相关；临床前过表达可减轻高脂饮食诱导的肝脂积累。现有药理TFEB激活剂多通过抑制mTORC1间接起作用，而mTORC1广泛表达，系统抑制可致免疫抑制、高脂血症和高血糖等，限制临床转化。因此研究人员用肝靶向脂质纳米颗粒（LNPs）递送TFEB mRNA，比较野生型TFEB与组成型活性TFEB S211A突变体，在细胞和CDAHFD诱导的小鼠MASLD模型中评价疗效与机制。该研究发表于《Molecular Biomedicine》，意义在于提供靶向、瞬时、非整合的遗传策略，并为MASLD精准干预提供机制基础。
关键技术方法：研究人员采用的公共数据包括GSE135251（216例不同非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAS）的肝活检RNA-seq）和GSE260617（HeLa、BeWo细胞TFEB ChIP-seq）。主要方法为：LNP制备与表征、荧光素酶体内成像、CDAHFD小鼠MASLD模型、Huh-7和HEK293A细胞模型、批量RNA-seq、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集、染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）、双荧光素酶启动子报告、小干扰RNA（siRNA）敲低，以及H&E、Sirius Red、BODIPY、F4/80、Oil Red O等组织学和血清/肝脏生化检测。
研究结果：（1）TFEB is dynamically dysregulated during MASLD progression：基于GSE135251的RNA-seq，TFEB表达随NAS从0到8呈双相变化（NAS1升高、中间下降、NAS8再轻度升高）；WGCNA显示TFEB位于turquoise模块，该模块与NAS0及NAS7–8正相关，富集巨自噬、囊泡运输和内体运输；VPS16、UBQLN4、MCOLN1等TFEB调控自噬基因与TFEB轨迹平行。结论：TFEB及下游自噬靶点在MASLD进展中动态调节，值得作为治疗靶点研究。（2）LNPs enable liver-targeted delivery of TFEB mRNA：制备包裹TFEB或S211A mRNA的LNPs，粒径约114–115 nm，封装效率近100%，CCK-8示细胞毒性可忽略；LNP-luciferase尾静脉注射显示强肝靶向，信号6 h峰值、48 h近不可测；50 μg LNP-luciferase 24 h血清ALT（丙氨酸转氨酶）、AST（天冬氨酸转氨酶）、ALP（碱性磷酸酶）和肌酐无显著变化，溶血<5%。结论：LNPs适合肝定向递送且急性肝/肾毒性和溶血风险低。（3）LNP-TFEB promotes autophagy and reduces lipid accumulation in Huh-7 cells：在Huh-7中LNP-TFEB和LNP-S211A增加TFEB表达和LC3-II/LC3-I比值，上调SQSTM1/P62、MAP1LC3、ATG7、ATG10及PPARGC1A、PPARA；PA诱导脂质积累后降低ACC（乙酰辅酶A羧化酶）、FASN（脂肪酸合酶）并升高LPL、HSL，Oil Red O示脂滴减少。结论：体外增强自噬、促脂解和脂氧化、抑脂合成，减少脂质积累。（4）LNP-TFEB attenuates CDAHFD-induced MASLD in mice：20 μg LNP-EGFP约60%肝细胞阳性；肝TFEB蛋白24 h峰值、48 h下降、72 h回基线，故每2天给药。CDAHFD 2周同时给LNP-EGFP、TFEB或S211A；体重无组间差异，CDAHFD增加肝重和肝指数，两治疗降低肝重；LNP-TFEB降低血清ALT/AST，肌酐无差异；总胆固醇相似，两治疗升高血清TG并降低肝TG；组织学未见心肾肺脾脂肪损伤；S211A降肝TG类似但未降AST/ALT，提示过度/持续激活安全窗较窄；未检出mTORC1活性影响。结论：肝靶向TFEB mRNA减轻肝损伤和肝脂质，S211A安全窗较窄。（5）LNP-TFEB and S211A enhance hepatic autophagy and lipid metabolic remodeling：Western blot示肝TFEB蛋白增加（FLAG确认），LC3-II/LC3-I升高、p62降低；PPARα、ATGL、CPT1A升高，FASN、ACC、SREBP1（固醇调节元件结合蛋白1）降低；qPCR示Map1lc3、Sqstm1增加，Atg7/Atg10中度增加，Ppara、Ppargc1a、Hsl、Lpl、Acadm、Acox1增强，Fasn、Mgat1、ApoB、Srebp1c、Mttp受抑；内源mTfeb轻度增加提示可能自调控。H&E/NAS降低，Sirius Red纤维面积减少，BODIPY脂滴减少，F4/80巨噬细胞浸润减少。结论：增强自噬和脂代谢重塑，减轻脂肪变性、纤维化改变和巨噬细胞浸润。（6）RNA sequencing reveals TFEB-dependent reprogramming of hepatic metabolism and inflammation：肝RNA-seq组内高相关；CDAHFD较chow上调细胞周期、炎症和免疫浸润基因（Ccr2、Ccr5、Itgam），下调Cpt1a、Fgf21；GO示炎症增强、脂肪酸代谢抑制；TFEB/S211A逆转Cpt1a、Fgf21下调并降低炎症基因；Venn示共享差异基因96上调、78下调；GO示脂代谢增强和炎症减弱；qPCR证实逆转Cpt1a、Fgf21及Acot1–4，抑制Gbp2、Gbp3、Gbp5；LNP-TFEB降低炎症和纤维化相关基因。结论：TFEB依赖的转录重编程促进脂代谢并抑制炎症。（7）TFEB activates FGF21 signaling during MASLD attenuation：LNP-TFEB增加肝Fgf21 mRNA；公共TFEB ChIP-seq（GSE260617，HeLa和BeWo）示FGF21启动子结合峰；ChIP-qPCR证实Huh-7中TFEB结合FGF21启动子CLEAR box；Torin1增加FGF21；siFGF21削弱LNP-TFEB/S211A诱导的MAP1LC3和CPT1A升高而不影响TFEB表达，Oil Red O示FGF21敲低削弱降脂；血清FGF21升高；双荧光素酶示TFEB通过CLEAR-box序列5′-gtcacgtgat-3′激活FGF21启动子；PPARα拮抗剂GW6471部分削弱降脂。结论：TFEB至少部分通过转录上调FGF21减轻MASLD相关脂质积累。
讨论总结：讨论指出小分子TFEB激活剂多经AMPK或mTORC1抑制间接促TFEB去磷酸化和核转位，系统抑制mTORC1可扰乱造血和全身代谢，故肝靶向TFEB mRNA主要作为研究肝脏TFEB生物学的临床前工具和未来MASLD干预起点。转录组示TFEB逆转MASLD诱导的Fgf21和Cpt1a抑制；FGF21具内分泌作用维持糖脂稳态，肝是啮齿类和人类FGF21主要来源；既往示FGF21经AMPK–MCOLN1–钙调磷酸酶调节TFEB，本研究提示肝TFEB过表达增加FGF21的互作；CPT1A促长链脂肪酸入线粒体β氧化。TFEB-FGF21轴可能贡献减轻MASLD肝损伤，但常规mTOR抑制剂激活TFEB是否依赖FGF21待定。LNP-TFEB降ALT/AST而S211A未提供 comparable保护，提示治疗窗窄；持续或过度TFEB激活可能破坏溶酶体/自噬稳态并矛盾性加重肝细胞损伤，需精确校准TFEB表达以维持自噬流于安全生理范围。局限：CDAHFD模型不能完全复现人类MASLD/MASH尤其肥胖和胰岛素抵抗；治疗2周较短，停药后持久性未知；未充分评估性别差异；FGF21沉默机制验证限于体外，需体内验证。未来需定义自噬阶段特异性作用，优化TFEB表达持续时间；每2天给药限制转化可行性，可探索自扩增TFEB mRNA延长表达并减少给药频率。
研究结论翻译：总体而言，瞬时肝靶向TFEB mRNA递送增加肝脏TFEB表达，改变自噬相关和脂质代谢程序，并在MASLD细胞和小鼠模型中减少肝脏脂质积累。数据确定FGF21为贡献TFEB相关脂质反应的转录靶点。尽管持久性、优化、长期安全性和体内通路依赖性尚待确定，这些发现支持肝靶向LNP-mRNA递送作为定义TFEB生物学的可控平台，并为未来代谢性肝病精准干预开发提供机制基础。
