《npj Dementia》：Shuttle systems for delivering antibody therapeutics across the BBB for the treatment of Alzheimer’s disease
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抗体正逐渐成为阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）的一种有前景的药物形式。然而，这些疗法在临床上的成功在一定程度上受到其无法穿越血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的限制。目前已尝试多种递送策略以使抗体治疗药物能够
抗体正逐渐成为阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）的一种有前景的药物形式。然而，这些疗法在临床上的成功在一定程度上受到其无法穿越血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的限制。目前已尝试多种递送策略以使抗体治疗药物能够绕过或穿越BBB；其中，整合靶向脑内皮细胞（brain endothelial cells，BECs）上转胞吞受体的组分仍是最主要的方法。在本综述中，研究人员聚焦于靶向转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）、胰岛素受体（insulin receptor，IR）、新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）及CD98重链（CD98 heavy chain，CD98hc）的BBB穿梭技术，并强调其各自的独特优势。将这些BBB穿梭技术整合到下一代AD抗体治疗药物中，将提高药物的脑内渗透率，从而提升临床疗效。
Introduction
Alzheimer’s disease (AD)
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，约影响70岁以上人群中30%的个体。由于人口老龄化，AD患者人数预计还将增加，凸显了有效治疗的迫切需求。目前已探索多种药物治疗AD或控制其症状的药理学方法，包括疫苗、反义寡核苷酸、小分子药物及单克隆抗体。然而，目前唯一获FDA批准的疾病修饰疗法是单克隆抗体。抗体相较于小分子药物具有显著优势，包括更高的特异性和更长的半衰期。
目前FDA批准用于AD治疗的抗体Lecanemab和Donanemab均靶向淀粉样蛋白β（amyloid beta，Aβ）。Aβ是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经β-分泌酶（如BACE1）及随后γ-分泌酶切割产生的一种胞外蛋白。针对BACE1的抗体和小分子抑制剂已被探索，但均未能在人类中延缓认知衰退。由于抗BACE1疗法的疗效有限且存在安全性问题，研究重点已转向直接靶向Aβ的抗体。Aβ主要以40或42个氨基酸的形式存在，可聚集形成寡聚体、原纤维，进而形成成熟纤维。成熟纤维是Aβ斑块的主要成分，是AD的标志性病理特征。然而，可溶性寡聚体可直接结合神经元并诱导突触功能障碍，可能与AD相关的认知损害有更直接的关联。临床试验中的不同抗Aβ抗体靶向不同的Aβ种类，这可能影响其治疗效果。靶向低分子量Aβ种类的抗体可通过阻断Aβ聚集或结合神经元发挥作用。然而，若抗体保留Fc效应功能，其主要作用机制是招募小胶质细胞清除有害Aβ，通过吞噬和内溶酶体降解实现清除。
虽然目前获批的抗Aβ抗体已减缓认知衰退，但在约20-40%的患者中，它们也会引起称为淀粉样蛋白相关影像学异常（amyloid-related imaging abnormalities，ARIA）的不良事件。在这些病例中，ARIA很可能是由抗体与脑血管壁相关的Aβ结合，激活小胶质细胞及其他免疫细胞并引起炎症反应所触发。ARIA可通过MRI检测，表现为ARIA-水肿/积液（ARIA-E）或ARIA-含铁血黄素沉积/微出血（ARIA-H）。ARIA通常无症状，但有时可引起头痛、意识模糊、恶心、癫痫发作，极少数情况下可导致死亡。载脂蛋白E ε4（APOE4）携带者发生ARIA的风险更高，但仍需更好地了解哪些其他人群风险最高。
AD的另一主要治疗靶点是tau。在生理条件下，tau是一种胞内蛋白，可稳定微管并促进细胞器的轴突运输。然而，在病理条件下，过度磷酸化等翻译后修饰会产生异常tau，其错误折叠并聚集形成神经原纤维缠结。这些神经原纤维缠结导致神经退行性疾病特征性的神经元突触丢失和细胞死亡。异常tau还可表现出“播种”现象，即被释放到胞外并被其他神经元摄取，从而促进正常tau的聚集。尽管AD症状与tau病理的相关性高于Aβ病理，但抗tau抗体并未取得同样的成功，因为它们通常仅靶向胞外tau并阻止播种。尽管如此，多种靶向tau不同区域/形式的抗体已进入临床试验。
由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的神经炎症也参与AD的发病。全基因组关联研究已鉴定出多种免疫相关受体和分泌蛋白，正被探索作为AD的治疗靶点。已进入临床试验的两个靶点是髓样细胞上表达的触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）和半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）。TREM2是一种小胶质细胞受体，可促进细胞存活、调节炎症并增强脂质碎片的清除。激活TREM2信号的激动剂抗体可促进小胶质细胞对有害Aβ的吞噬。Gal-3是一种可溶性蛋白，可结合β-半乳糖苷酶，已被证明可促进细胞粘附和炎症。在AD中，Gal-3由小胶质细胞分泌并促进Aβ寡聚化；这一效应可被治疗性抗体阻断。尽管靶向Aβ、tau、TREM2和Gal-3的单特异性抗体在逆转人类AD病理方面已显示出一定成功，但其疗效受到血脑屏障（BBB）穿透能力差的限制。
Blood–brain barrier (BBB)
大脑是一个具有高度调控界面的特权部位，这些界面控制物质和细胞进出大脑的运动。这些屏障的例子包括脑膜屏障、脑室屏障，以及值得注意的血脑屏障（BBB）。这些屏障对于维持稳态和保护大脑环境至关重要。然而，这些屏障对中枢神经系统（CNS）药物递送构成了挑战，因为大多数小分子治疗药物以及所有大分子治疗药物（如抗体，即本综述的重点）的渗透性有限。
当抗体CNS治疗药物通过静脉（IV）、腹腔（IP）或皮下（SC）途径全身给药时，BBB尤为重要。BBB是血管与脑实质之间的屏障。血管被一层连续的脑内皮细胞（BECs）包裹，细胞间通过紧密连接相连。该层被含有嵌入的周细胞和星形胶质细胞终足的基底膜包围。与其他血液-内皮屏障相比，BBB具有极低的非特异性转运率。只有小于400 Da的分子才能自然扩散通过，因此需要特异性转运体来运输葡萄糖、氨基酸和铁等必需营养素。此外，BBB含有高水平的外排泵，如P-糖蛋白，可清除潜在毒素。然而，这些外排泵仅对小分子CNS药物递送构成重大挑战。
血浆中仅约0.1%的抗体治疗药物能到达脑实质。允许这一少量运输的机制尚不清楚。然而，许多人推测其通过相对更具渗透性的血-脑脊液屏障和脑脊液-脑屏障发生被动扩散，因为确实进入脑实质的抗体通常位于脑室附近。此外，人们普遍认为AD会破坏BBB，增加其对抗体的渗透性。然而，一项研究表明，在多种AD小鼠模型中，抗体脑内浓度与正常小鼠相比保持不变。尽管AD患者中抗体治疗药物自然穿越BBB存在困难，但大脑的高度血管化特性为靶向CNS药物递送提供了途径。
Strategies for antibody delivery to the brain
Invasive methods
目前有几种方法用于将基于抗体的CNS治疗药物递送至大脑。一些方法是侵入性的，例如直接脑内注射或脊髓注射，抗体从脑脊液（CSF）进入脑实质。这些技术可使高比例的抗体到达大脑；然而，抗体并不总是均匀分布。更重要的是，这些操作对患者不便且风险较高。
Non-invasive, non-specific methods
相比之下，非侵入性递送方法更易实施且风险更低。非侵入性方法可分为非特异性或特异性两类。非特异性方法涉及打开或绕过BBB以允许抗体进入。一种打开BBB的非特异性方法是甘露醇注射。动脉内注射甘露醇会引起渗透压变化，在整个BBB中产生间隙，使治疗药物扩散进入脑实质。该技术已在临床上用于增强抗体治疗药物向脑肿瘤的递送。另一种打开BBB的方法，但具有更大的空间和时间控制能力，是使用微泡的聚焦超声（focused ultrasound，FUS）。该方法涉及注射微泡，然后使用低强度FUS使其破裂，导致靶向区域紧密连接暂时打开，随后治疗药物通过细胞旁转运。该技术在AD小鼠模型和一小部分AD患者中已显示出疗效，但仍存在一定风险。最后，鼻内给药可用于绕过BBB。在该方法中，治疗药物被认为可通过两条途径之一进入大脑：神经元摄取及随后的神经元内运输，或扩散进入蛛网膜下腔，然后进入脑实质。虽然该方法有前景，但它需要低剂量和高生物利用度，这可能并非所有AD抗体治疗药物都可行。
Targeting receptor-mediated transcytosis (RMT) receptors
基于抗体的疗法也可以通过附着BBB靶向组分来特异性递送至大脑。这些疗法随后可通过结合受体介导的转胞吞（RMT）或转运体介导的转胞吞（TMT）靶标直接穿越BECs。RMT在治疗性抗体递送方面比TMT得到更广泛的靶向。RMT利用基于受体的内体运输将关键蛋白带过BECs。首先，蛋白与BEC腔面（面向血液侧）的受体结合。蛋白-受体复合物随后被内吞，通常通过网格蛋白依赖性途径。接下来，蛋白被分选进入转胞吞途径，在该途径中通过细胞质运输并在腔外（面向大脑侧）释放到脑间质液中。同时，受体被分选进入回收途径，在腔面释放回血液。为利用这一运输机制，治疗药物可包含天然配体，或更常见的是靶向RMT受体的抗体。最常被靶向的RMT受体包括脂蛋白受体相关蛋白（LRPs）、胰岛素样生长因子受体（IGF1R）、转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体（IR）和新生儿Fc受体（FcRn）。靶向LRP1的肽Angiopep-2已在化疗药物脑递送的临床试验中得到评估。此外，一项研究表明靶向LDLR的肽可用于递送抗体Fc片段。然而，这些靶向LRP的方法在治疗性抗体递送方面仍处于早期开发阶段。靶向IGF1R的抗体已在临床前研究中证明可递送治疗性肽、酶和抗体。然而，近年来对该穿梭系统的兴趣有所减弱，且尚未用于递送AD治疗药物。在本综述中，研究人员聚焦于已在临床上用于递送大分子治疗药物的方法，如TfR和IR，以及近期在AD抗体治疗药物递送方面具有临床前证据的方法，如FcRn。
Transferrin receptor (TfR)
转铁蛋白受体（TfR）是研究最多的用于将抗体治疗药物递送穿越BBB的靶标。TfR于20世纪80年代首次在大脑毛细血管中被发现。TfR有两种主要亚型：TfR1在大脑中高表达、在其他组织中低表达，而TfR2主要在肝脏中表达。TfR是一种II型跨膜受体，可结合铁结合的转铁蛋白（transferrin，Tf）。它由三个结构域组成：顶端结构域、解旋酶结构域和蛋白酶样结构域。Tf结合于解旋酶和蛋白酶样结构域。为穿越BECs，全铁（铁结合）-Tf在腔面与TfR结合。全铁Tf-TfR复合物进入早期内体，在低pH条件下铁从Tf释放。铁通过二价金属转运体1（divalent metal transporter 1，DMT1）输出至胞质，然后在腔外侧面直接释放或在细胞外囊泡内释放。无铁（脱铁）-Tf-TfR复合物被引导至回收内体并运输回腔面，脱铁-Tf在此被释放回血流。
抗体和其他类型的CNS治疗药物可整合抗TfR部分（如抗体）以利用该途径穿越BBB。然而，必须考虑几个重要因素。在BECs之外，未成熟红细胞是主要高表达TfR的细胞类型。用未修饰的抗TfR抗体治疗小鼠通常通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）导致网织红细胞耗竭。消除抗体Fc效应功能可消除该效应。因此，大多数用于体内的抗TfR抗体都经过Fc沉默突变工程改造，如L234A/L235A（LALA）、L234A/L235A/P329G（LALAPG）或L234A/L235A/D265S（LALADS），以防止这种脱靶效应。此外，抗TfR抗体不得与全铁-Tf竞争结合，以避免减少脑铁摄取。为实现这一点，许多抗体被工程化以结合TfR顶端结构域，该结构域不与Tf相互作用。
此外，抗体对TfR的亲和力需要仔细优化。如果亲和力过高，它们将保持与TfR结合，这会触发更多的溶酶体途径分选以及抗体和受体的降解。相反，如果亲和力过低，抗体将无法充分结合TfR以诱导转胞吞。只有具有中等亲和力的抗体才会主要被分选进入转胞吞途径，涉及Rab17表达和分选小管定位，然后在BECs腔外侧面解离。这种设计使其能够释放进入脑实质，促进完整的CNS治疗疗效。
另一个挑战是鉴定能与不同动物物种TfR交叉反应的抗体。理想情况下，结合人TfR的抗体也应结合小鼠TfR和/或非人灵长类（non-human primate，NHP）TfR，如食蟹猴TfR，以实现完全代表性的临床前测试。由于猴和人TfR1顶端结构域之间的序列相似性>95%，研究人员已轻松鉴定出食蟹猴/人交叉反应抗体。然而，由于物种间TfR顶端结构域仅有>73%的序列相似性，鉴定小鼠/人交叉反应抗体已被证明具有挑战性。
Genentech的一个研究团队率先证明抗TfR抗体可用于将大分子治疗药物运输穿越BBB。首先，他们生成了多种对小鼠TfR具有不同亲和力的抗体。当以20 mg/kg静脉注射到小鼠体内时，所有抗体在给药后1天均达到显著高于对照的脑浓度。重要的是，对TfR亲和力较低的抗体表现出更高的脑浓度，且与实质而非血管的关联更强。接下来，利用“杵臼”（knobs-into-holes，KiH）技术以最小化重链错配，作者生成了双特异性抗体，其一臂靶向TfR，另一臂靶向BACE1。亲本抗TfR抗体对TfR具有高亲和力，而双特异性抗体由于从二价降至单价而具有较低亲和力。在相同条件下注射到小鼠体内时，双特异性抗体在给药后1天的脑浓度比亲本抗BACE1抗体高5倍。此外，当以25 mg/kg或50 mg/kg给药时，双特异性抗体在给药后1天和2天比抗BACE1抗体更能降低脑Aβ水平。
Janssen开发了其自身的基于TfR的穿梭系统，用于将抗体治疗药物递送至人脑，称为TfR转胞吞增强分子（transcytosis-enabling molecules，TEMs）。通过用人TfR蛋白免疫啮齿动物、分离抗体并进行体外筛选，他们生成了对人TfR具有一系列亲和力的抗体面板。排名前七的候选抗体被转化为scFv格式……
