《Cell Regeneration》：A novel strategy to generate human iPSCs with enhanced mesodermal and endodermal differentiation capacity
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诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限的增殖能力和多谱系分化潜能。自体iPSC来源的细胞可降低免疫排斥风险，使其成为再生医学中极具前景的资源。然而，采用传统方法衍生的iPSCs常表现出异质性，且部分细胞存在分化潜能缺陷。为克服上述局限性，研究人员开发了一种新型重
诱导多能干细胞（iPSCs）具有无限的增殖能力和多谱系分化潜能。自体iPSC来源的细胞可降低免疫排斥风险，使其成为再生医学中极具前景的资源。然而，采用传统方法衍生的iPSCs常表现出异质性，且部分细胞存在分化潜能缺陷。为克服上述局限性，研究人员开发了一种新型重编程策略，称为“4CL-primed”策略，该策略在重编程过程中引入短暂的早期多能性（4CL）处理。4CL-primed iPSCs保留了传统iPSCs的核心特征，包括正常的形态、多能性标志物表达和核型稳定性，同时表现出增强的中胚层和内胚层分化能力。此外，这些细胞在定向胰腺谱系分化中表现出更优的性能，产生了更高比例的胰腺内分泌β样细胞。综上所述，4CL-primed策略为中胚层和内胚层分化研究，特别是胰腺谱系分化，提供了一种更实用的方法，从而为再生医学和细胞治疗提供了更高效的胰腺谱系细胞来源。
论文解读
一、研究背景与目的
多能干细胞（PSCs）包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），具有无限的体外增殖能力，并可在体内外分化为三个胚层的所有细胞类型。人ESCs来源于囊胚，而人iPSCs（hiPSCs）通过体细胞重编程产生。凭借自我更新和多谱系分化能力，PSCs为再生医学、疾病建模和药物发现提供了宝贵的多功能细胞来源。特别是hiPSCs可由患者特异性体细胞产生，支持自体细胞治疗，在疾病机制研究、治疗化合物筛选和临床转化方面具有广阔前景。
然而，若干挑战阻碍了其临床应用。iPSCs中检测到的基因突变和染色体畸变引发了对其致瘤性的担忧。另一个主要障碍是不同iPSC细胞系之间分化能力的变异性。部分hiPSC克隆在神经干/祖细胞分化过程中保留未分化细胞，将这些细胞移植到免疫缺陷小鼠脑内可导致畸胎瘤形成。在造血分化过程中也观察到类似的分化缺陷。在分子水平上，检测到与原始体细胞和完全重编程iPSCs均不同的异常转录和表观遗传模式，这些偏差被视为重编程错误，主要表现为异常DNA甲基化。早期研究将这种异质性归因于遗传背景，后续研究揭示重编程方法本身也影响所得iPSCs的质量和稳定性。
为解决这些表观遗传异常并提高iPSC质量，近期研究探索了重编程过程的改进方案。一项研究报告了“TNT”（瞬时幼稚处理）重编程策略，在传统重编程过程中增加瞬时幼稚处理步骤，模拟早期胚胎发育中的全基因组DNA去甲基化。TNT重编程增强了来自不同细胞类型的hiPSCs的分化能力，并纠正了表观遗传记忆和异常。在过去十年中，不同的多能性状态（包括幼稚态、引发态、形成态和类全能态）已被捕获和培养，这些状态表现出不同的表观遗传特征。其中，4CL培养条件已被证明可促进引发态PSCs向类全能8细胞胚胎样状态转变，代表比幼稚态更早的发育阶段。
基于上述发现，研究人员假设在重编程过程中引入短暂的4CL早期多能性处理可促进更彻底的表观遗传重置，从而产生具有增强分化能力的iPSCs。本研究开发了一种称为“4CL-primed”的新型重编程策略，在人PBMCs重编程过程中引入10天4CL处理，并评估了该策略产生iPSCs的体外分化潜能。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从全血中分离PBMCs，经扩增后使用四个附加型质粒进行电穿孔转染。转染后细胞分别在reproTeSR培养基（传统方法）或4CL培养基（4CL-primed策略）中培养，随后换为mTeSR1培养基直至iPSC克隆被手动挑取，整个重编程过程约需25-30天。4CL培养基包含DZNep、TSA、PD0325901、IWR-1、人LIF、activin A和L-抗坏血酸等成分。研究采用的主要技术方法包括：qRT-PCR分析多能性及谱系标志物表达、免疫荧光染色检测蛋白表达、流式细胞术定量标志物阳性细胞比例、核型分析评估遗传稳定性、畸胎瘤形成实验验证体内多能性，以及定向分化实验评估三胚层分化能力。
三、研究结果
建立改进的iPSC生成重编程策略
研究人员设计了包含10天4CL处理的“4CL-primed重编程策略”。初步生成并筛选了每组四个独立的iPSC细胞系，选择两个具有稳健生长特征的代表性细胞系进行深入验证。两个细胞系均表现出相同的形态学特征。qRT-PCR分析显示，传统和4CL-primed iPSC细胞系均表达核心多能性基因OCT4、NANOG和SOX2。免疫荧光分析进一步证实两组细胞中OCT4和NANOG蛋白的稳健表达。核型分析显示，即使传代超过30次，两种iPSC细胞系均维持正常核型。这些结果表明新重编程策略产生的iPSCs具有与传统iPSCs相似的分子特征，且两种细胞系在长期体外培养中保持遗传稳定。
研究人员进一步评估了iPSCs的分化能力。体外胚状体（EB）形成实验显示4CL-primed iPSCs形成正常EBs，与传统iPSC来源的EBs大小相当。9天EBs的qRT-PCR分析揭示了向三胚层谱系的稳健分化潜能，与体内畸胎瘤形成实验结果一致。
4CL-primed iPSCs表现出增强的中胚层和内胚层分化能力
研究人员首先将4CL-primed iPSCs定向分化为中胚层谱系细胞。免疫荧光结果显示，4CL-primed iPSCs产生了显著更高比例的T阳性细胞。qRT-PCR分析显示，与传统iPSCs相比，4CL-primed iPSCs中中胚层谱系基因（EOMES、MIXL1、T）表达显著升高，多能性基因（OCT4、NANOG、SOX2）表达显著降低。流式细胞术分析T阳性细胞的结果与免疫荧光结果一致。
随后研究人员将iPSCs定向分化为定型内胚层。免疫荧光分析显示，传统iPSCs在分化后保留了大量OCT4阳性细胞，而4CL-primed iPSCs表现出更高效的FOXA2表达。流式细胞术分析显示4CL-primed组中CXCR4?/SOX17?双阳性细胞显著增加。qRT-PCR结果一致显示4CL-primed组FOXA2和SOX17表达更高，OCT4和SOX2表达更低。
在外胚层分化方面，免疫荧光图像提示4CL-primed iPSCs来源的细胞表现出更均一的PAX6表达，但定量分析显示两组间PAX6阳性细胞百分比无显著差异，流式细胞术分析也证实PAX6阳性细胞比例相当。这些发现证实了4CL-primed iPSCs的体外分化潜能，并进一步证明其与传统iPSCs相比具有增强的中胚层和内胚层分化能力。
4CL-primed iPSCs可定向分化为胰腺内分泌β样细胞
研究人员应用已建立的胰腺谱系分化系统进一步评估4CL-primed iPSCs的分化能力。在定型内胚层阶段之后，获得了PDX1阳性胰腺祖细胞。4CL-primed iPSCs产生更多PDX1阳性细胞且分布更均一。qRT-PCR证实PDX1表达显著上调。诱导过程后，分化细胞共表达PDX1和NKX6-1，4CL-primed组中PDX1?和NKX6-1?细胞百分比显著高于传统组。qRT-PCR显示胰腺内胚层基因（PDX1、NKX6-1、NGN3、PTF1A、P48、CK19）表达显著变化。
研究人员进一步评估β样细胞的生成，检测功能标志物C肽（C-Pep）和转录因子NKX6-1的表达。免疫荧光显示4CL-primed iPSCs产生更多C-Pep/NKX6-1双阳性细胞。qRT-PCR分析显示，与传统iPSCs相比，4CL-primed组中关键β细胞转录因子（INS、GCG、NGN3、NKX6-1、PDX1、PAX4、GLUT2、ISL1、NEUROD1、CK19、AMY2A）表达显著升高，δ细胞转录因子（SST）表达降低。这些结果表明4CL-primed iPSCs可以更高效地分化为胰腺谱系细胞，包括C肽阳性β样细胞。
四、讨论与结论
讨论部分指出，4CL-primed iPSCs在重编程效率、形态、增殖、多能性基因表达和核型等基本特征方面与传统iPSCs相似，并在长期培养中维持核型稳定性。在定向分化系统中，4CL-primed iPSCs不仅高效分化为三胚层衍生物，而且与传统iPSCs相比，在中胚层和内胚层谱系分化效率、相关谱系标志物表达强度以及所得细胞群体的均质性方面均表现更优。在胰岛分化中，4CL-primed iPSCs同样产生了更多C-Pep阳性细胞。
然而，研究人员也指出，虽然4CL-primed iPSCs表现出胰腺和β细胞标志物（包括C肽和NKX6-1）表达增加，但标志物表达本身并不能确定功能身份或成熟度。葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验和胰岛素/C肽释放的定量测量对于评估这些β样细胞的功能至关重要。此外，RNA-seq分析将提供更全面的胰腺β样细胞分子定义，是关键的后续研究方向。
研究人员推测，重编程过程中短暂的4CL处理促进了更彻底的表观遗传重置——包括更完全的DNA去甲基化和残留体细胞表观遗传记忆的消除——从而产生具有更强分化潜能的iPSCs。这一假说与4CL促进类8细胞胚胎早期多能性状态的观察一致，该阶段代表全局表观遗传重塑时期。然而，这种改善是否反映残留或异常表观遗传记忆（如异常DNA甲基化）的消除，需要通过全基因组表观遗传分析进一步研究。
研究结论为：本研究开发了一种新型“4CL-primed”重编程策略，该策略能高效地将体细胞重编程为iPSCs，与传统方法建立的细胞相比具有更优的中胚层和内胚层分化能力。这一新策略为基于细胞的再生医学提供了胰腺谱系分化的有前景的替代细胞来源。
